都柏林沙门氏菌△phoQ-△rpoS双缺失株的构建与初步应用

发布时间：2022-01-23 20:25

　　都柏林沙门氏菌（S. dublin）是引起犊牛副伤寒的主要病原菌之一。犊牛副伤寒以顽固性下痢为典型症状,常引起犊牛大规模发病,死亡率较高,给养牛业造成了重大损失。同时,受感染的动物、污染牛肉或消毒不彻底的牛奶及奶制品,是引发人食物中毒的重要的感染源。因此,其在兽医和公共卫生方面均具有非常重要的意义。疫苗接种是预防犊牛副伤寒的最佳手段。在我国,唯一的牛副伤寒活疫苗是将抗原性良好的都柏林沙门氏菌强毒株利用醋酸砣致弱法选育出的免疫原性良好的弱毒株。此疫苗采用化学诱变致弱,具有致弱的遗传背景不够清楚、存在毒力返强的风险与保留部分残留毒力的缺点。本研究旨在研制更加安全有效、遗传背景清晰、有明确的标记来区分疫苗接种与野毒感染的新的都柏林沙门氏菌基因缺失减毒疫苗,为犊牛副伤寒病的防控奠定一定的理论和试验基础。主要内容如下：1. S. dublin AphoQ单缺失株和△phoQ-△rpoS双缺失株的构建基于phoQ、rpoS基因的已知序列,利用λ噬菌体Red重组系统依次对都柏林沙门氏菌CICC21497的phoQ、rpoS基因进行缺失,构建出△phoQ单缺失株和△phoQ-△rpoS双缺失株,并利用... 

【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：71 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
缩略词(Abbreviation)
1 前言
    1.1 研究问题的由来
    1.2 文献综述
        1.2.1 都柏林沙门氏菌病的研究概况
        1.2.2 沙门氏菌疫苗研究进展
        1.2.3 Red同源重组技术
    1.3 研究的目的与意义
2 材料与方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 菌株、质粒和细胞系
        2.1.2 药品与试剂
        2.1.3 主要培养基及其配制
        2.1.4 主要试剂与缓冲液的配制
        2.1.5 本实验所用PCR引物
        2.1.6 实验动物
    2.2 实验方法
        2.2.1 都柏林沙门氏菌缺失株的构建
        2.2.2 都柏林沙门氏菌缺失株生物学特性鉴定
        2.2.3 都柏林沙门氏菌缺失株对小鼠的毒力实验
        2.2.4 都柏林沙门氏菌缺失株粘附力与侵袭力鉴定
        2.2.5 都柏林沙门氏菌缺失株对小鼠的免疫原性实验
        2.2.6 都柏林沙门氏菌缺失株对小鼠的免疫保护实验
        2.2.7 都柏林沙门氏菌缺失株对小鼠的交叉保护实验
        2.2.8 菌株与树突状细胞的相互作用
        2.2.9 统计学分析
3 结果与分析
    3.1 都柏林沙门氏菌ΔphoQ单缺失株、ΔphoQ-ΔrpoS双缺失株的构建
        3.1.1 同源臂构建
        3.1.2 PCR鉴定质粒pKD46转入目的菌株
        3.1.3 第一次同源重组菌ΔphoQ::cat、ΔphoQ-ΔrpoS::cat的PCR鉴定
        3.1.4 第二次重组菌ΔphoQ、ΔphoQ-ΔrpoS的鉴定
    3.2 都柏林沙门氏菌缺失株生物学特性鉴定
        3.2.1 都柏林沙门氏菌缺失株生长特性鉴定
        3.2.2 都柏林沙门氏菌缺失株生化特性鉴定
    3.3 都柏林沙门氏菌缺失株对小鼠的毒力试验
    3.4 都柏林沙门氏菌缺失株对HEp-2细胞的粘附与侵袭
        3.4.1 都柏林沙门氏菌缺失株对HEp-2细胞的粘附
        3.4.2 都柏林沙门氏菌缺失株对HEp-2细胞的侵袭
    3.5 都柏林沙门氏菌缺失株免疫原性检测
        3.5.1 都柏林沙门氏菌IgG抗体水平检测
        3.5.2 血清中细胞因子的检测
        3.5.3 沙门氏菌菌体抗原刺激淋巴细胞增殖分析
        3.5.4 免疫小鼠的CD4~+T细胞水平分析
    3.6 都柏林沙门氏菌缺失株免疫保护试验
    3.7 缺失株的交叉保护试验
    3.8 不同菌株与树突状细胞的相互作用
        3.8.1 感染不同菌株后树突状细胞分泌IFN-γ的检测
        3.8.2 感染不同菌株后树突状细胞分泌TNF-α的检测
        3.8.3 感染不同菌株后树突状细胞分泌IL-10的检测
        3.8.4 感染不同菌株后树突状细胞分泌IL-12p70的检测
        3.8.5 感染不同菌株后树突状细胞分泌IL-23的检测
4 讨论
    4.1 Red重组系统的应用
    4.2 phoQ、rpoS缺失对毒力的影响
    4.3 phoQ、rpoS缺失对免疫原性的影响
    4.4 缺失株的交叉保护力
5 结论
参考文献
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]沙门氏菌毒力相关因子研究进展[J]. 陈冬平,罗薇.  西南民族大学学报(自然科学版). 2012(05)
[2]沙门氏菌减毒及其作为疫苗活载体的研究进展[J]. 张明亮,张春杰,程相朝.  生物学杂志. 2012(02)
[3]一起交叉污染所致沙门氏菌食物中毒的流行病学调查分析[J]. 高春玉,苏俊锋,王善雨.  中国卫生监督杂志. 2011(03)
[4]亚利桑那沙门氏菌食物中毒72例临床分析[J]. 彭易根,张正群.  现代医药卫生. 2011(04)
[5]CD4+ T淋巴细胞功能研究新进展[J]. 孙君重,肖文华,于力.  中国实验血液学杂志. 2010(02)
[6]沙门氏菌检验技术的研究进展[J]. 陈伯祥.  国外畜牧学(猪与禽). 2010(01)
[7]鼠伤寒沙门菌感染对小鼠Th1/Th2影响的动态研究[J]. 杨涛毅,彭珉娟,万朝敏,陈桂华,叶蕾.  西部医学. 2009(01)
[8]Red重组系统用于大肠杆菌基因修饰研究进展[J]. 张雪,温廷益.  中国生物工程杂志. 2008(12)
[9]沙门氏菌感染T细胞激活的研究[J]. 李妤蓉,马涛,赵金媛,李朝争.  社区医学杂志. 2007(09)
[10]树突状细胞在沙门氏菌感染获得性免疫中的作用[J]. 潘志明,黄金林.  国外医学(免疫学分册). 2005(06)

博士论文
[1]猪霍乱沙门氏菌C500株crpˉ、asdˉ缺失株平衡致死系统的构建及应用[D]. 徐引弟.华中农业大学 2006

硕士论文
[1]猪霍乱沙门氏菌C78-1株crp缺失株的构建及其生物学特性初步研究[D]. 郁川.河南科技大学 2010



本文编号：3605093