犬降钙素原蛋白多克隆抗体制备及应用分析

发布时间：2022-01-25 19:19

　　试验旨在获得高纯度犬降钙素原（procalcitonin,PCT）重组蛋白,并对该蛋白的临床应用进行分析。采用大肠杆菌表达外源蛋白的方法,将PCT基因克隆至原核表达载体pET-30a（+）中,经双酶切和测序鉴定阳性的重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,以终浓度为1 mmol/L的IPTG诱导表达,采用镍柱进行重组蛋白的纯化,纯化蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体,间接ELISA法检测抗体效价,Western blotting检测重组蛋白与犬PCT多克隆抗体的特异性,采用ELISA法检测健康犬和炎症犬血清PCT。双酶切及测序结果显示,犬PCT基因成功插入pET-30a（+）,未出现碱基突变;SDS-PAGE结果显示,重组蛋白以可溶性形式表达,分子质量为14.9 ku,间接ELISA法测定的免疫小鼠血清抗体效价达1∶51 200。Western blotting结果表明,制备的多抗血清具有很好的特异性;ELISA结果显示,炎症犬血清内检测到PCT,且其浓度与炎症反应程度呈正相关。结果表明,本研究成功制备了犬PCT蛋白多克隆抗体,且犬血清PCT蛋白是一种潜在的新型严重细菌性炎症感染指示... 

【文章来源】：中国畜牧兽医. 2020,47(03)北大核心

【文章页数】：10 页

【部分图文】：

重组表达载体的构建

将目的基因与原核表达载体pET-30a(+)连接构建重组表达载体,重组表达载体pET-30a-PCT用BamH Ⅰ和Nde Ⅰ进行双酶切,琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物,在5 270和350 bp处各有一条清晰的条带(图2),与预期片段大小相符。测序结果显示,犬PCT基因成功插入pET-30a(+),无突变移码。2.2 重组蛋白的表达及验证

取阳性重组菌进行扩增培养,经IPTG诱导后进行15% SDS-PAGE分析。结果显示,28 ℃、IPTG终浓度为1.0 mmol/L、诱导9 h后在上清中发现14.9 ku的明显条带,且与预期大小相符,空质粒无条带出现,说明犬PCT蛋白在这一诱导条件下可溶性表达较高(图3A)。随后,以抗His标签的抗体作为一抗进行Western blotting分析,结果显示,在14.9 ku处出现一条明显的反应条带(图3B),表明His-PCT重组蛋白能够表达。2.3 重组蛋白的纯化

【参考文献】：
期刊论文
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本文编号：3609069