猪流行性腹泻病毒感染性克隆的构建及猪圆环病毒2型感染猪肺泡巨噬细胞转录组学研究
发布时间：2022-02-11 17:49
猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea, PED）是一种急性、高度传播性的肠道疾病,该病由猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV）引起,以急性肠炎、呕吐、水样腹泻和脱水等为主要临床特征。PED于2010年起在中国再次爆发,该次流行主要以变异毒株的出现为特征,造成80%-100%的哺乳仔猪发病,50%-90%的仔猪死亡。后来该病于2013年5月在美国爆发,给养猪业带来了极大的经济损失。猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2, PCV2）是引起猪圆环病毒相关疾病的重要病原,给当前养猪业造成极大的经济损失,其靶细胞主要是单核巨噬细胞系统和树突状细胞,其感染后主要的临床组织病变为淋巴细胞减少和炎性细胞浸润,最终导致机体免疫功能抑制,从而继发感染其他细菌和病毒。本论文针对这两种猪的重要病原,主要研究内容如下：1.PEDV的流行病学调查通过对2011年2月至2011年10月间从华中、华东、华南、西南地区12个省份的57个猪场采的455份临床样品（包括粪便样品、小肠样品和乳汁样品）,用RT-P...
【文章来源】：华中农业大学湖北省211工程院校教育部直属院校
【文章页数】：169 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
缩略语表(ABBREVIATION)
第1章 文献综述
1.1 猪流行性腹泻病毒研究进展
1.1.1 PED的流行
1.1.2 PEDV的分类地位
1.1.3 PEDV的分子结构
1.1.4 5'UTR和3’UTR
1.1.5 复制酶基因ORF1
1.1.6 S基因的结构、功能及应用
1.1.7 M基因的结构与功能
1.1.8 E基因的结构与功能
1.1.9 ORF3基因的结构与功能
1.1.10 N基因的结构与功能
1.1.11 PEDV的受体研究进展
1.2 冠状病毒感染性克隆研究进展
1.3 猪圆环病毒研究进展
1.3.1 猪圆环病毒概述
1.3.2 PCV2生物学特性
1.3.3 PCV2基因组成
1.3.4 PCV2编码的蛋白质
1.3.5 PCV2病毒的复制
1.3.6 PCV2的传播途径
1.3.7 PCV2感染与临床疾病
1.3.8 PCV2致病机理
1.3.9 PCV2与宿主免疫系统的相互作用
第2章 PEDV CHGDU株感染性克隆的构建
2.1 研究的目的及意义
2.2 材料与方法
2.2.1 病料
2.2.2 细胞与菌株
2.2.3 载体与质粒
2.2.4 工具酶及主要试剂
2.2.5 重要仪器和设备
2.2.6 培养基配制
2.2.7 感受态细胞制备
2.2.8 分子生物学分析软件
2.3 试验方法
2.3.1 病料采集与处理
2.3.2 病毒的分离
2.3.3 PEDV的增殖
2.3.4 TCID_(50)的测定
2.3.5 病毒RNA提取
2.3.6 引物的设计与合成
2.3.7 反转录合成cDNA
2.3.8 质粒转染实验
2.3.9 间接免疫荧光(IFA)
2.3.10 RNA定向重组
2.3.1 1病毒空斑纯化
2.3.12 病毒生长曲线的绘制
2.3.13 重组病毒对胰蛋白酶依赖性测定
2.3.14 MLV系统构建稳定细胞系Vero-hTMPRSS2-HA筛选
2.3.15 hTMPRSS2在重组病毒感染过程中的作用
2.4 实验结果与分析
2.4.1 猪流行性腹泻病毒流行病学调查
2.4.2 病毒的分离
2.4.3 PEDV CHGDU株病毒毒价的测定
2.4.4 病毒的RT-PCR检测
2.4.5 间接免疫荧光实验(IFA)
2.4.6 病毒的S基因全长序列测定及分析
2.4.7 病毒的S基因全长克隆及IFA验证
2.4.8 穿梭质粒pPEDV-CHGDU-S-Flag-dORF3/GFP的构建
2.4.9 重组病毒rPEDV-DR13-S~(CHGDU)-Flag-dORF3/GFP的拯救
2.4.10 重组病毒rPEDV-DR13-S~(CHGDU)-Flag-dORF3/GFP生长曲线的绘制
2.4.11 rPEDV-DR13-S~(CHGDU)-Flag-dORF3/GFP对胰蛋白酶依赖性测定
2.4.12 稳定表达蛋白酶hTMPRSS2的Vero-CCL81细胞系的构建
2.4.13 蛋白酶TMPRSS2在PEDV感染中的作用测定
2.5 讨论
2.5.1 PEDV流行病学调查及CHGDU毒株的分离鉴定
2.5.2 PEDV CHGDU株S基因全长测序及序列分析
2.5.3 重组病毒rPEDV-DR13-S~(CHGDU)-Flag-dORF3/GFP的拯救
2.6 小结
第3章 猪圆环病毒2型感染猪肺泡巨噬细胞转录组学研究
3.1 研究目的及意义
3.2 材料与方法
3.2.1 毒株及细胞
3.2.2 培养基与相关试剂的配制
3.2.3 主要试剂
3.2.4 主要仪器
3.2.5 试验动物
3.2.6 肺泡巨噬细胞的分离鉴定
3.2.7 PCV2感染实验设计
3.2.8 肺泡巨噬细胞总RNA的提取
3.2.9 样品RNA荧光标记
3.2.10 芯片的杂交与清洗
3.2.11 基因芯片扫描
3.2.12 基因芯片图像的采集与数据分析
3.2.13 芯片结果实时荧光定量PCR分析
3.2.14 细胞因子检测
3.2.15 差异表达基因的互作分析
3.2.16 统计学分析
3.3 实验结果与分析
3.3.1 感染前仔猪的检测
3.3.2 PCV2感染后和qPCR和IFA检测结果
3.3.3 样品RNA质量检测
3.3.4 芯片杂交结果及差异表达基因GO聚类分析
3.3.5 差异基因互作网络分析
3.3.6 芯片结果qPCR验证
3.3.7 PCV2感染后细胞上清中细胞因子检测
3.4 讨论
3.4.1 CD74在PCV2感染中的作用
3.4.2 Toll样受体通路分析
3.4.3 MHCII类分子与PCV2感染
3.4.4 细胞凋亡和生长抑制
3.4.5 钙结合蛋白在PCV2感染中的作用
3.4.6 炎症反应
3.5 小结
第4章 结论
参考文献
附录
附录1 CHGDU毒株S基因核苷酸序列
附录2 CHGDU毒株S蛋白氨基酸序列
附录3 rPEDV-DR13-SCHGDU-Flag-dORF3/GFP S基因的氨基酸序列
附表1 PCV2感染后猪肺泡巨噬细胞差异表达的可注释的基因
附表2 差异表达基因生物学进程(GO)分析
个人资料
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]猪流行性腹泻病毒COE核酸疫苗的构建及免疫原性[J]. 向敏,张洁,高其双,卢顺,陈志华,黄海军,陶弼菲,彭霞,占才耀,夏瑜,童伟文,华娟,王连芳. 中国兽医学报. 2013(11)
[2]猪病毒性腹泻分子流行病学调查[J]. 刘云波,赵洪翠,王志成,武刚,何启盖. 中国畜牧兽医. 2013(02)
[3]2011年福建省猪流行性腹泻的流行特点及其防治措施[J]. 张世忠,江斌. 福建畜牧兽医. 2012(02)
[4]2011年猪流行性腹泻病毒的遗传变异分析[J]. 刘孝珍,陈建飞,时洪艳,张鑫,石达,刘胜旺,冯力. 中国预防兽医学报. 2012(03)
[5]猪流行性腹泻病毒核衣壳蛋白与感染细胞核磷蛋白的共定位分析[J]. 吕茂杰,陈建飞,时洪艳,陈小金,范秀萍,申识川,冯力. 微生物学报. 2011(05)
[6]猪流行性腹泻流行特点及流行现状的研究[J]. 甘振磊,汤德元,李春燕,王彬,张晓杰,王凤,刘志杰. 猪业科学. 2010(12)
[7]猪流行性腹泻的实验室诊断方法[J]. 李思银,杨亮宇,杨玉艾. 猪业科学. 2010(12)
[8]猪流行性腹泻病毒基因及其疫苗的研究[J]. 王凤,汤德元,李春燕,王彬,张晓杰,甘振磊,刘志杰. 猪业科学. 2010(12)
[9]猪流行性腹泻病毒S蛋白受体结合域的分析[J]. 孙东波,陈建飞,时洪艳,申识川,吕茂杰,范秀萍,陈洪岩,冯力. 畜牧兽医学报. 2009(04)
[10]表达猪流行性腹泻病毒COE基因的重组乳酸菌的构建与鉴定[J]. 董丽娜,高凤山,许崇波,胡桂学,姜海龙. 畜牧兽医学报. 2008(12)
硕士论文
[1]猪钙结合蛋白S100A9、S100A12在PCV2感染猪肾细胞（PK-15）中的功能研究[D]. 刘羽茜.华中农业大学 2012
[2]猪流行性腹泻病毒重组沙门氏菌的构建及免疫原性分析[D]. 徐丽丽.华中农业大学 2011
[3]猪病毒性腹泻多重RT-PCR诊断方法的建立和应用及猪轮状病毒的分离[D]. 张坤.华中农业大学 2010
[4]猪流行性腹泻病毒地方株LJB/03株分离鉴定[D]. 张桂红.东北农业大学 2008
本文编号：3620696
【文章来源】：华中农业大学湖北省211工程院校教育部直属院校
【文章页数】：169 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
缩略语表(ABBREVIATION)
第1章 文献综述
1.1 猪流行性腹泻病毒研究进展
1.1.1 PED的流行
1.1.2 PEDV的分类地位
1.1.3 PEDV的分子结构
1.1.4 5'UTR和3’UTR
1.1.5 复制酶基因ORF1
1.1.6 S基因的结构、功能及应用
1.1.7 M基因的结构与功能
1.1.8 E基因的结构与功能
1.1.9 ORF3基因的结构与功能
1.1.10 N基因的结构与功能
1.1.11 PEDV的受体研究进展
1.2 冠状病毒感染性克隆研究进展
1.3 猪圆环病毒研究进展
1.3.1 猪圆环病毒概述
1.3.2 PCV2生物学特性
1.3.3 PCV2基因组成
1.3.4 PCV2编码的蛋白质
1.3.5 PCV2病毒的复制
1.3.6 PCV2的传播途径
1.3.7 PCV2感染与临床疾病
1.3.8 PCV2致病机理
1.3.9 PCV2与宿主免疫系统的相互作用
第2章 PEDV CHGDU株感染性克隆的构建
2.1 研究的目的及意义
2.2 材料与方法
2.2.1 病料
2.2.2 细胞与菌株
2.2.3 载体与质粒
2.2.4 工具酶及主要试剂
2.2.5 重要仪器和设备
2.2.6 培养基配制
2.2.7 感受态细胞制备
2.2.8 分子生物学分析软件
2.3 试验方法
2.3.1 病料采集与处理
2.3.2 病毒的分离
2.3.3 PEDV的增殖
2.3.4 TCID_(50)的测定
2.3.5 病毒RNA提取
2.3.6 引物的设计与合成
2.3.7 反转录合成cDNA
2.3.8 质粒转染实验
2.3.9 间接免疫荧光(IFA)
2.3.10 RNA定向重组
2.3.1 1病毒空斑纯化
2.3.12 病毒生长曲线的绘制
2.3.13 重组病毒对胰蛋白酶依赖性测定
2.3.14 MLV系统构建稳定细胞系Vero-hTMPRSS2-HA筛选
2.3.15 hTMPRSS2在重组病毒感染过程中的作用
2.4 实验结果与分析
2.4.1 猪流行性腹泻病毒流行病学调查
2.4.2 病毒的分离
2.4.3 PEDV CHGDU株病毒毒价的测定
2.4.4 病毒的RT-PCR检测
2.4.5 间接免疫荧光实验(IFA)
2.4.6 病毒的S基因全长序列测定及分析
2.4.7 病毒的S基因全长克隆及IFA验证
2.4.8 穿梭质粒pPEDV-CHGDU-S-Flag-dORF3/GFP的构建
2.4.9 重组病毒rPEDV-DR13-S~(CHGDU)-Flag-dORF3/GFP的拯救
2.4.10 重组病毒rPEDV-DR13-S~(CHGDU)-Flag-dORF3/GFP生长曲线的绘制
2.4.11 rPEDV-DR13-S~(CHGDU)-Flag-dORF3/GFP对胰蛋白酶依赖性测定
2.4.12 稳定表达蛋白酶hTMPRSS2的Vero-CCL81细胞系的构建
2.4.13 蛋白酶TMPRSS2在PEDV感染中的作用测定
2.5 讨论
2.5.1 PEDV流行病学调查及CHGDU毒株的分离鉴定
2.5.2 PEDV CHGDU株S基因全长测序及序列分析
2.5.3 重组病毒rPEDV-DR13-S~(CHGDU)-Flag-dORF3/GFP的拯救
2.6 小结
第3章 猪圆环病毒2型感染猪肺泡巨噬细胞转录组学研究
3.1 研究目的及意义
3.2 材料与方法
3.2.1 毒株及细胞
3.2.2 培养基与相关试剂的配制
3.2.3 主要试剂
3.2.4 主要仪器
3.2.5 试验动物
3.2.6 肺泡巨噬细胞的分离鉴定
3.2.7 PCV2感染实验设计
3.2.8 肺泡巨噬细胞总RNA的提取
3.2.9 样品RNA荧光标记
3.2.10 芯片的杂交与清洗
3.2.11 基因芯片扫描
3.2.12 基因芯片图像的采集与数据分析
3.2.13 芯片结果实时荧光定量PCR分析
3.2.14 细胞因子检测
3.2.15 差异表达基因的互作分析
3.2.16 统计学分析
3.3 实验结果与分析
3.3.1 感染前仔猪的检测
3.3.2 PCV2感染后和qPCR和IFA检测结果
3.3.3 样品RNA质量检测
3.3.4 芯片杂交结果及差异表达基因GO聚类分析
3.3.5 差异基因互作网络分析
3.3.6 芯片结果qPCR验证
3.3.7 PCV2感染后细胞上清中细胞因子检测
3.4 讨论
3.4.1 CD74在PCV2感染中的作用
3.4.2 Toll样受体通路分析
3.4.3 MHCII类分子与PCV2感染
3.4.4 细胞凋亡和生长抑制
3.4.5 钙结合蛋白在PCV2感染中的作用
3.4.6 炎症反应
3.5 小结
第4章 结论
参考文献
附录
附录1 CHGDU毒株S基因核苷酸序列
附录2 CHGDU毒株S蛋白氨基酸序列
附录3 rPEDV-DR13-SCHGDU-Flag-dORF3/GFP S基因的氨基酸序列
附表1 PCV2感染后猪肺泡巨噬细胞差异表达的可注释的基因
附表2 差异表达基因生物学进程(GO)分析
个人资料
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]猪流行性腹泻病毒COE核酸疫苗的构建及免疫原性[J]. 向敏,张洁,高其双,卢顺,陈志华,黄海军,陶弼菲,彭霞,占才耀,夏瑜,童伟文,华娟,王连芳. 中国兽医学报. 2013(11)
[2]猪病毒性腹泻分子流行病学调查[J]. 刘云波,赵洪翠,王志成,武刚,何启盖. 中国畜牧兽医. 2013(02)
[3]2011年福建省猪流行性腹泻的流行特点及其防治措施[J]. 张世忠,江斌. 福建畜牧兽医. 2012(02)
[4]2011年猪流行性腹泻病毒的遗传变异分析[J]. 刘孝珍,陈建飞,时洪艳,张鑫,石达,刘胜旺,冯力. 中国预防兽医学报. 2012(03)
[5]猪流行性腹泻病毒核衣壳蛋白与感染细胞核磷蛋白的共定位分析[J]. 吕茂杰,陈建飞,时洪艳,陈小金,范秀萍,申识川,冯力. 微生物学报. 2011(05)
[6]猪流行性腹泻流行特点及流行现状的研究[J]. 甘振磊,汤德元,李春燕,王彬,张晓杰,王凤,刘志杰. 猪业科学. 2010(12)
[7]猪流行性腹泻的实验室诊断方法[J]. 李思银,杨亮宇,杨玉艾. 猪业科学. 2010(12)
[8]猪流行性腹泻病毒基因及其疫苗的研究[J]. 王凤,汤德元,李春燕,王彬,张晓杰,甘振磊,刘志杰. 猪业科学. 2010(12)
[9]猪流行性腹泻病毒S蛋白受体结合域的分析[J]. 孙东波,陈建飞,时洪艳,申识川,吕茂杰,范秀萍,陈洪岩,冯力. 畜牧兽医学报. 2009(04)
[10]表达猪流行性腹泻病毒COE基因的重组乳酸菌的构建与鉴定[J]. 董丽娜,高凤山,许崇波,胡桂学,姜海龙. 畜牧兽医学报. 2008(12)
硕士论文
[1]猪钙结合蛋白S100A9、S100A12在PCV2感染猪肾细胞（PK-15）中的功能研究[D]. 刘羽茜.华中农业大学 2012
[2]猪流行性腹泻病毒重组沙门氏菌的构建及免疫原性分析[D]. 徐丽丽.华中农业大学 2011
[3]猪病毒性腹泻多重RT-PCR诊断方法的建立和应用及猪轮状病毒的分离[D]. 张坤.华中农业大学 2010
[4]猪流行性腹泻病毒地方株LJB/03株分离鉴定[D]. 张桂红.东北农业大学 2008
本文编号：3620696
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