鸡柔嫩艾美耳球虫蛋白SAG13分子功能初步研究
发布时间：2022-02-21 11:10
柔嫩艾美耳球虫（E.tenella）是分布最广、致病力最强的几种球虫之一,严重危害养禽业,造成重大的经济损失。目前药物防治是控制球虫病的有效手段,但随着抗球虫株的产生及绿色食品概念的形成,抗球虫新型疫苗的研究成为热点。E.tenella SAG13表面抗原蛋白是基于DF-1细胞感染模型,通过分泌蛋白质组分析筛选到的一种上调表达蛋白。为探究EtSAG13是否具有分泌特性,以及是否可以作为候选疫苗抗原蛋白,本研究对EtSAG13基因进行原核表达,以E.tenella子孢子cDNA为模板进行扩增,按照GenBank的基因序列合成引物,将合成的EtSAG13基因序列连接到pET28a（+）载体上,构建了pET28a-SAG13重组质粒,并将pET28a-SAG13重组质粒转化至大肠杆菌BL21中,利用IPTG诱导EtSAG13目的基因的表达;用SDS-PAGE及免疫印迹法对表达蛋白进行分析和鉴定。将EtSAG13表达的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,制备鼠源多克隆抗体,进行亚细胞定位,EtSAG13定位在E.tenella子孢子的表面,同时部分蛋白可以分泌到裂殖子细胞外,具有分泌特性。本研究将p...
【文章来源】：山东农业大学山东省
【文章页数】：62 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
符号说明
中文摘要
Abstract
前言
1.1 鸡球虫病概述
1.2 鸡球虫研究进展
1.2.1 鸡球虫分子生物学研究进展
1.2.2 鸡球虫分泌蛋白研究概况
1.2.2.1 微线蛋白
1.2.2.2 蛋白激酶
1.2.2.3 棒状体蛋白
1.3 鸡球虫病防治概况
1.3.1 药物防治
1.3.2 疫苗研究进展
1.3.2.1 鸡球虫免疫机制
1.3.2.2 传统疫苗和商品化疫苗
1.3.2.3 新型疫苗研究进展
1.3.3 鸡球虫免疫应答的研究进展
1.4 EtSAGs家族蛋白
1.5 本研究的目的和意义
2.材料与方法
2.1 试验材料
2.1.1 试验菌株和载体
2.1.2 试验动物与虫株
2.1.3 主要试剂及试剂盒
2.1.4 主要仪器设备
2.1.5 溶液配制
2.2 试验方法
2.2.1 引物设计与合成
2.2.2 鸡球虫复壮与传代
2.2.3 鸡球虫的收集与孢子化卵囊的收集
2.2.4 EtSAG13 基因的克隆与原核表达载体的构建
2.2.4.1 EtSAG13 基因克隆与转化
2.2.4.2 EtSAG13 基因片段PCR产物的回收
2.2.4.3 EtSAG13 目的基因片段和载体双酶切和胶回收
2.2.4.4 目的基因酶切产物与pET-28a(+)载体的连接
2.2.4.5 重组质粒转化入Top10 感受态细胞
2.2.4.6 重组质粒的菌液PCR鉴定
2.2.4.7 重组质粒DNA的提取与鉴定
2.2.4.8 阳性克隆质粒测序鉴定
2.2.5 EtSAG13 重组蛋白的表达和纯化
2.2.5.1 EtSAG13 重组蛋白的原核表达
2.2.5.2 EtSAG13 重组蛋白SDS-PAGE和 Western blot检测
2.2.5.3 重组EtSAG13 蛋白纯化
2.2.6 EtSAG13 鼠源多克隆抗体的制备及分泌蛋白鉴定
2.2.6.1 EtSAG13 鼠源多克隆抗体的制备
2.2.6.2 EtSAG13 的亚细胞定位分泌蛋白鉴定
2.2.7 SAG13 蛋白免疫保护效果评价
2.2.7.1 动物试验设计与免疫程序
2.2.7.2 EtSAG13 亚单位疫苗免疫保护效果评价
2.2.7.2.1 存活率
2.2.7.2.2 增重效果
2.2.7.2.3 卵囊排出量
2.2.7.2.4 盲肠病变计分
2.2.7.2.5 抗球虫指数(ACI)评价
2.2.7.2.6 血清和粘膜抗体检测
2.2.7.2.7 细胞免疫水平的检测
2.2.7.2.8 统计分析
3 结果
3.1 SAG13 基因的克隆与原核表达载体的构建
3.2 EtSAG13 重组克隆载体的测序结果
3.3 EtSAG13 多克隆抗体的制备及鉴定结果
3.3.1 SDS-PAGE与 Western Blot验证EtSAG13 蛋白的原核表达
3.3.2 EtSAG13 原核重组蛋白的大量诱导及纯化
3.3.3 鼠源多克隆抗体的制备及分泌蛋白鉴定结果
3.3.4 E.tenella虫体EtSAG13 蛋白间接免疫荧光定位结果
3.4 EtSAG13 亚单位疫苗免疫保护效果的评价
3.4.1 体重增长情况
3.4.2 盲肠病变计分
3.4.3 卵囊排出量
3.4.4 抗球虫指数(ACI)结果
3.4.5 血清抗体水平检测结果
3.4.6 粘膜抗体水平检测结果
3.4.7 CD4~+、CD8~+T 淋巴细胞亚群检测结果
4 讨论
4.1 EtSAG13 重组蛋白分泌蛋白鉴定
4.2 原核表达EtSAG13 蛋白的意义及其免疫保护效果
4.3 血液抗体和粘膜抗体以及T淋巴细胞在抗球虫感染免疫保护中的作用
5 结论
参考文献
附录
致谢
论文发表情况
【参考文献】：
期刊论文
[1]我国鸡球虫病研究的回顾、现状与展望简述[J]. 汤新明,李超,胡丹丹,张思新,段春慧,毕菲菲,刘婕,刘贤勇,索勋. 寄生虫与医学昆虫学报. 2019(03)
[2]中药复方制剂对鸡柔嫩艾美耳球虫的疗效试验[J]. 王黎霞,曹允,马建民,张成昆,张建军,安健. 中国兽医杂志. 2019(08)
[3]免疫组织化学方法检测皮损组织中C3d,C4d,IgG,IgG4及CD123表达在诊断自身免疫性皮肤病中的应用价值[J]. 邓敏,周星雨,张静,李亚萍. 中南大学学报(医学版). 2019(08)
[4]人免疫球蛋白重链可变区基因的特征分析[J]. 石彬,马嘉欣,涂文静,吴皓明,陈先恋. 聊城大学学报(自然科学版). 2019(04)
[5]中药在鸡球虫病治疗中的应用[J]. 李随霞. 畜禽业. 2019(01)
[6]免疫球蛋白G提纯方法的研究进展[J]. 李登亮,伊淑帅,郭衍冰,刘宏凯,牛江婷,董国英,胡桂学. 中国兽医杂志. 2018(12)
[7]中药防治鸡球虫病的进展情况[J]. 王海森. 中国畜禽种业. 2018(11)
[8]海南霉素预混剂对鸡柔嫩艾美耳球虫病的疗效试验[J]. 顾梦恬,周婷婷,胡雪,全家兴,卜仕金. 中国家禽. 2018(09)
[9]鸡柔嫩艾美耳球虫表面抗原蛋白SAG17的生物信息学分析[J]. 王英贺,曹利利,郭衍冰,董航,姚新华,许志林,魏峰,苑淑贤. 黑龙江畜牧兽医. 2017(23)
[10]柔嫩艾美耳球虫两种表面抗原基因的原核表达与鉴定[J]. 陈会亚,费陈忠,杨帆帆,王霄旸,薛飞群. 动物医学进展. 2017(07)
博士论文
[1]柔嫩艾美耳球虫表面抗原EtSAG4、EtSAG16和EtSAG22的免疫保护效果研究[D]. 谭理.华中农业大学 2018
[2]新型酿酒酵母表面展示系统的构建及鸡球虫EtMic2活载体疫苗的免疫保护性研究[D]. 孙慧.山东农业大学 2014
[3]堆型艾美耳球虫乳酸脱氢酶DNA疫苗免疫保护作用及免疫机理研究[D]. 宋鸿雁.南京农业大学 2010
硕士论文
[1]中药方剂防治鸡柔嫩艾美耳球虫病的效果研究[D]. 赵瑞平.河南农业大学 2019
[2]柔嫩艾美耳球虫S07-IL-2与NA4-IL-2重组酵母蛋白的表达及其免疫效果评价[D]. 陈艳红.吉林农业大学 2019
[3]混合益生菌抗鸡柔嫩艾美耳球虫感染效果评价[D]. 都慧洁.山东农业大学 2019
[4]表面展示柔嫩艾美耳球虫EtMIC2蛋白重组乳酸菌的构建及免疫保护效果研究[D]. 周芳玉.吉林农业大学 2016
[5]鸡柔嫩艾美耳球虫多表位亚单位疫苗的构建与免疫保护效果的评价[D]. 韩林臻.山东农业大学 2016
[6]毒害艾美耳球虫第二代裂殖子cDNA文库的构建与筛选及3-1E基因的克隆表达[D]. 蔡秀清.扬州大学 2016
[7]柔嫩艾美耳球虫Etgam59基因克隆表达与免疫保护性研究[D]. 朱玉兰.扬州大学 2015
[8]巨型艾美耳球虫Emgam56基因在毕赤酵母中的表达及其免疫保护性研究[D]. 邓长静.扬州大学 2015
[9]酵母表面展示EtMic1蛋白不同结构域及其作为抗球虫活载体疫苗的研究[D]. 陈佩佩.山东农业大学 2014
[10]鸡柔嫩艾美耳球虫RC株表面抗原SAG17、SAG18和未知蛋白HP基因的克隆与原核表达[D]. 许李丽.西南大学 2013
本文编号：3637131
【文章来源】：山东农业大学山东省
【文章页数】：62 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
符号说明
中文摘要
Abstract
前言
1.1 鸡球虫病概述
1.2 鸡球虫研究进展
1.2.1 鸡球虫分子生物学研究进展
1.2.2 鸡球虫分泌蛋白研究概况
1.2.2.1 微线蛋白
1.2.2.2 蛋白激酶
1.2.2.3 棒状体蛋白
1.3 鸡球虫病防治概况
1.3.1 药物防治
1.3.2 疫苗研究进展
1.3.2.1 鸡球虫免疫机制
1.3.2.2 传统疫苗和商品化疫苗
1.3.2.3 新型疫苗研究进展
1.3.3 鸡球虫免疫应答的研究进展
1.4 EtSAGs家族蛋白
1.5 本研究的目的和意义
2.材料与方法
2.1 试验材料
2.1.1 试验菌株和载体
2.1.2 试验动物与虫株
2.1.3 主要试剂及试剂盒
2.1.4 主要仪器设备
2.1.5 溶液配制
2.2 试验方法
2.2.1 引物设计与合成
2.2.2 鸡球虫复壮与传代
2.2.3 鸡球虫的收集与孢子化卵囊的收集
2.2.4 EtSAG13 基因的克隆与原核表达载体的构建
2.2.4.1 EtSAG13 基因克隆与转化
2.2.4.2 EtSAG13 基因片段PCR产物的回收
2.2.4.3 EtSAG13 目的基因片段和载体双酶切和胶回收
2.2.4.4 目的基因酶切产物与pET-28a(+)载体的连接
2.2.4.5 重组质粒转化入Top10 感受态细胞
2.2.4.6 重组质粒的菌液PCR鉴定
2.2.4.7 重组质粒DNA的提取与鉴定
2.2.4.8 阳性克隆质粒测序鉴定
2.2.5 EtSAG13 重组蛋白的表达和纯化
2.2.5.1 EtSAG13 重组蛋白的原核表达
2.2.5.2 EtSAG13 重组蛋白SDS-PAGE和 Western blot检测
2.2.5.3 重组EtSAG13 蛋白纯化
2.2.6 EtSAG13 鼠源多克隆抗体的制备及分泌蛋白鉴定
2.2.6.1 EtSAG13 鼠源多克隆抗体的制备
2.2.6.2 EtSAG13 的亚细胞定位分泌蛋白鉴定
2.2.7 SAG13 蛋白免疫保护效果评价
2.2.7.1 动物试验设计与免疫程序
2.2.7.2 EtSAG13 亚单位疫苗免疫保护效果评价
2.2.7.2.1 存活率
2.2.7.2.2 增重效果
2.2.7.2.3 卵囊排出量
2.2.7.2.4 盲肠病变计分
2.2.7.2.5 抗球虫指数(ACI)评价
2.2.7.2.6 血清和粘膜抗体检测
2.2.7.2.7 细胞免疫水平的检测
2.2.7.2.8 统计分析
3 结果
3.1 SAG13 基因的克隆与原核表达载体的构建
3.2 EtSAG13 重组克隆载体的测序结果
3.3 EtSAG13 多克隆抗体的制备及鉴定结果
3.3.1 SDS-PAGE与 Western Blot验证EtSAG13 蛋白的原核表达
3.3.2 EtSAG13 原核重组蛋白的大量诱导及纯化
3.3.3 鼠源多克隆抗体的制备及分泌蛋白鉴定结果
3.3.4 E.tenella虫体EtSAG13 蛋白间接免疫荧光定位结果
3.4 EtSAG13 亚单位疫苗免疫保护效果的评价
3.4.1 体重增长情况
3.4.2 盲肠病变计分
3.4.3 卵囊排出量
3.4.4 抗球虫指数(ACI)结果
3.4.5 血清抗体水平检测结果
3.4.6 粘膜抗体水平检测结果
3.4.7 CD4~+、CD8~+T 淋巴细胞亚群检测结果
4 讨论
4.1 EtSAG13 重组蛋白分泌蛋白鉴定
4.2 原核表达EtSAG13 蛋白的意义及其免疫保护效果
4.3 血液抗体和粘膜抗体以及T淋巴细胞在抗球虫感染免疫保护中的作用
5 结论
参考文献
附录
致谢
论文发表情况
【参考文献】：
期刊论文
[1]我国鸡球虫病研究的回顾、现状与展望简述[J]. 汤新明,李超,胡丹丹,张思新,段春慧,毕菲菲,刘婕,刘贤勇,索勋. 寄生虫与医学昆虫学报. 2019(03)
[2]中药复方制剂对鸡柔嫩艾美耳球虫的疗效试验[J]. 王黎霞,曹允,马建民,张成昆,张建军,安健. 中国兽医杂志. 2019(08)
[3]免疫组织化学方法检测皮损组织中C3d,C4d,IgG,IgG4及CD123表达在诊断自身免疫性皮肤病中的应用价值[J]. 邓敏,周星雨,张静,李亚萍. 中南大学学报(医学版). 2019(08)
[4]人免疫球蛋白重链可变区基因的特征分析[J]. 石彬,马嘉欣,涂文静,吴皓明,陈先恋. 聊城大学学报(自然科学版). 2019(04)
[5]中药在鸡球虫病治疗中的应用[J]. 李随霞. 畜禽业. 2019(01)
[6]免疫球蛋白G提纯方法的研究进展[J]. 李登亮,伊淑帅,郭衍冰,刘宏凯,牛江婷,董国英,胡桂学. 中国兽医杂志. 2018(12)
[7]中药防治鸡球虫病的进展情况[J]. 王海森. 中国畜禽种业. 2018(11)
[8]海南霉素预混剂对鸡柔嫩艾美耳球虫病的疗效试验[J]. 顾梦恬,周婷婷,胡雪,全家兴,卜仕金. 中国家禽. 2018(09)
[9]鸡柔嫩艾美耳球虫表面抗原蛋白SAG17的生物信息学分析[J]. 王英贺,曹利利,郭衍冰,董航,姚新华,许志林,魏峰,苑淑贤. 黑龙江畜牧兽医. 2017(23)
[10]柔嫩艾美耳球虫两种表面抗原基因的原核表达与鉴定[J]. 陈会亚,费陈忠,杨帆帆,王霄旸,薛飞群. 动物医学进展. 2017(07)
博士论文
[1]柔嫩艾美耳球虫表面抗原EtSAG4、EtSAG16和EtSAG22的免疫保护效果研究[D]. 谭理.华中农业大学 2018
[2]新型酿酒酵母表面展示系统的构建及鸡球虫EtMic2活载体疫苗的免疫保护性研究[D]. 孙慧.山东农业大学 2014
[3]堆型艾美耳球虫乳酸脱氢酶DNA疫苗免疫保护作用及免疫机理研究[D]. 宋鸿雁.南京农业大学 2010
硕士论文
[1]中药方剂防治鸡柔嫩艾美耳球虫病的效果研究[D]. 赵瑞平.河南农业大学 2019
[2]柔嫩艾美耳球虫S07-IL-2与NA4-IL-2重组酵母蛋白的表达及其免疫效果评价[D]. 陈艳红.吉林农业大学 2019
[3]混合益生菌抗鸡柔嫩艾美耳球虫感染效果评价[D]. 都慧洁.山东农业大学 2019
[4]表面展示柔嫩艾美耳球虫EtMIC2蛋白重组乳酸菌的构建及免疫保护效果研究[D]. 周芳玉.吉林农业大学 2016
[5]鸡柔嫩艾美耳球虫多表位亚单位疫苗的构建与免疫保护效果的评价[D]. 韩林臻.山东农业大学 2016
[6]毒害艾美耳球虫第二代裂殖子cDNA文库的构建与筛选及3-1E基因的克隆表达[D]. 蔡秀清.扬州大学 2016
[7]柔嫩艾美耳球虫Etgam59基因克隆表达与免疫保护性研究[D]. 朱玉兰.扬州大学 2015
[8]巨型艾美耳球虫Emgam56基因在毕赤酵母中的表达及其免疫保护性研究[D]. 邓长静.扬州大学 2015
[9]酵母表面展示EtMic1蛋白不同结构域及其作为抗球虫活载体疫苗的研究[D]. 陈佩佩.山东农业大学 2014
[10]鸡柔嫩艾美耳球虫RC株表面抗原SAG17、SAG18和未知蛋白HP基因的克隆与原核表达[D]. 许李丽.西南大学 2013
本文编号：3637131
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