抗猪CD46禽源单链噬菌体展示抗体库的构建及特异性抗体的筛选

发布时间：2022-02-21 12:51

　　噬菌体展示技术是单克隆抗体筛选的关键技术之一，在抗体筛选领域中的应用占有越来越大的比例。CD46又称辅膜蛋白，是广泛存在于有核细胞表面的一种受体，在哺乳动物中相对保守，并在先天免疫的补体的激活和调节的经典途径和替代途径中起着关键作用，除此之外CD46还是一些病毒和细菌的细胞受体。本研究充分利用哺乳动物保守蛋白在禽源免疫系统中具有更高的免疫原性，结合禽源抗体可变区基因更易克隆扩增的优势，采用噬菌体展示技术构建抗猪源CD46的单链抗体库，并从中筛选出特异性抗CD46的scFv，为高亲和力、高特异性禽源单克隆抗体的制备提供技术支撑。本研究采用DNA和蛋白复合免疫的方式免疫SPF公鸡，先用真核表达载体pcDNA-CD46和pCAGG-CD46免疫，然后用原核表达的CD46-His融合蛋白为免疫原。监测血清效价，经4次免疫，分离脾脏B淋巴细胞，提取总RNA后反转录成cDNA，根据文献报道的引物分别扩增VH和VL基因，经重叠PCR大量扩增scFv。选取Sfi I和Not I为酶切位点，酶切消化scFv和pCANTAB5E后，用T4DNA连接酶，将scFv基因连接入pCANTAB5E噬菌粒载体，并将... 

【文章来源】：西北农林科技大学陕西省211工程院校985工程院校教育部直属院校

【文章页数】：54 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第一章 文献综述
    1.1 噬菌体展示抗体技术研究进展
        1.1.1 噬菌体展示基本形式
        1.1.2 噬菌体展示抗体库技术的改进
        1.1.3 噬菌体展示技术的最新应用
    1.2 鸡 IgY 抗体简介
    1.3 CD46 研究进展
    1.4 本研究的目的和意义
第二章 噬菌体展示抗体库的构建和特异性抗体的筛选
    2.1 试验材料
        2.1.1 菌株与质粒
        2.1.2 试验动物
        2.1.3 主要试剂
        2.1.4 主要仪器设备
        2.1.5 主要培养基的配置
    2.2 方法
        2.2.1 CD46-His 融合蛋白的诱导表达
        2.2.2 融合蛋白的 Western blot 分析
        2.2.3 pET-30a-CD46/BL21 菌体的处理
        2.2.4 CD46-His 融合蛋白的纯化
        2.2.5 包涵体蛋白复性
        2.2.6 pMal-c2x-CD46 载体的构建
        2.2.7 CD46-MBP 融合蛋白的表达纯化
        2.2.8 Western Blot 分析
        2.2.9 SPF 鸡的免疫
        2.2.10 scFv 抗体库的构建
        2.2.11 抗体库的多样性鉴定
        2.2.12 特异性抗体的淘选
        2.2.13 Phage ELISA 筛选高特异性 scFv
    2.3 结果与分析
        2.3.1 免疫原的特性
        2.3.2 免疫后血清的特异性
        2.3.3 抗体可变区基因的扩增
        2.3.4 抗体库的构建
        2.3.5 噬菌体抗体库的多样性
        2.3.6 抗体库的淘选
    2.4 讨论
        2.4.1 抗原的原核表达
        2.4.2 抗体库的构建
        2.4.3 抗体库的淘选效率
        2.4.4 特异性 phage-scFv 的筛选
结论
参考文献
致谢
作者简介



本文编号：3637288