CRISPR/Cas9介导敲除内蒙古白绒山羊胎儿成纤维细胞FGF5基因
发布时间：2022-02-22 19:20
内蒙古白绒山羊是优秀的绒山羊品种,产出高品质羊绒,在全球享有盛誉。提高羊绒产量一直是绒山羊品种选育的重要任务,分子育种为品种改良提供了新手段。RNA引导的CRISPR/Cas9核酸内切酶系统是近年发展起来的基因定点编辑技术,它通过一段短的RNA序列与DNA靶序列通过碱基互补原则形成双链,后结合Cas9蛋白在DNA靶位点诱导形成双链断裂损伤（double-stranded break,DSBs）,DSBs修复时可以在基因组靶位点引入特殊的基因突变,具有设计简单,打靶效率高及能在靶位点形成多种突变的优点。成纤维细胞生长因子5（fibroblast growth factor 5,FGF5）是影响毛囊周期性活动及绒毛生长的重要生长因子,是一个已知的最强有力的控制毛囊从生长期向休止期转化的因子。敲除FGF5基因可以解除对毛囊生长周期的控制,促进绒毛生长。本文针对内蒙古白绒山羊FGF5基因设计了特异性的“向导RNA”分子（Single guide RNA, sgRNA）,并对该sgRNA的潜在脱靶位点进行预测,构建特异于内蒙古白绒山羊FGF5基因的CRISPR/Cas9表达载体,转染胎儿成纤维细...
【文章来源】：内蒙古大学内蒙古自治区211工程院校
【文章页数】：59 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第一章 文献综述
1.1 CRISPR/Cas基因组定点编辑技术的建立
1.1.1 CRISPR/Cas系统的发现与分类
1.1.2 CRISPR/Cas9系统的作用机制
1.1.3 CRISPR/Cas9技术的发展及成熟
1.2 CRISPR/Cas9技术在转基因动物中的应用
1.2.1 在基因敲除中的应用
1.2.2 在基因定点整合中的应用
1.2.3 在基因转录调控中的应用
1.2.4 CRISPR/Cas9技术相比其他基因编辑技术的应用优势
1.3 CRISPR/Cas9的脱靶效应及改进措施的研究
1.4 结语
参考文献
第二章 CRISPR/Cas9表达载体的构建
2.1 材料
2.1.1 主要仪器设备
2.1.2 化学试剂与耗材
2.1.3 实验材料
2.2 方法
2.2.1 靶位点的选取及gRNA的设计
2.2.2 潜在脱靶位点的确定
2.2.3 CRISPR/Cas9骨架载体的构建
2.2.4 靶位点基因PCR引物设计及反应条件优化
2.3 结果
2.3.1 靶位点的选取与sgRNA的确定
2.3.2 脱靶位点的确定
2.3.3 CRISPR/Cas9骨架载体的构建及测序验证
2.3.4 靶位点基因PCR引物设计及条件优化
2.4 讨论
第三章 定点敲除FGF5基因的内蒙古白绒山羊胎儿成纤维细胞系筛选及脱靶位点的验证
3.1 材料
3.1.1 主要仪器设备
3.1.2 化学试剂与耗材
3.1.3 实验材料
3.2 方法
3.2.1 绒山羊胎儿成纤维细胞脂质体转染体系的优化
3.2.2 CRISPR/Cas9表达载体转染绒山羊胎儿成纤维细胞
3.2.3 SURVEYOR酶切活性验证及体系的优化
3.2.4 Surveyor酶切验证转染后的绒山羊胎儿成纤维细胞系pool克隆
3.2.5 测序验证转染后的绒山羊胎儿成纤维细胞系pool克隆
3.2.6 FGF5基因敲除突变单克隆的获得
3.2.7 FGF5基因敲除单克隆测序验证
3.2.8 脱靶位点的验证
3.3 结果
3.3.1 脂质体法转染条件的优化
3.3.2 SURVEYOR酶切活性验证及体系的优化
3.3.3 转染CRISPR/Cas9特异性表达载体后pool克隆Surveyor酶切验证
3.3.4 转染CRISPR/Cas9特异性表达载体后pool克隆测序验证
3.3.5 敲除FGF5基因绒山羊胎儿成纤维细胞阳性单克隆细胞系的获得及鉴定
3.3.6 潜在脱靶位点的验证
3.4 讨论
结论
攻读硕士学位期间所发表的学术论文
致谢
本文编号：3640072
【文章来源】：内蒙古大学内蒙古自治区211工程院校
【文章页数】：59 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第一章 文献综述
1.1 CRISPR/Cas基因组定点编辑技术的建立
1.1.1 CRISPR/Cas系统的发现与分类
1.1.2 CRISPR/Cas9系统的作用机制
1.1.3 CRISPR/Cas9技术的发展及成熟
1.2 CRISPR/Cas9技术在转基因动物中的应用
1.2.1 在基因敲除中的应用
1.2.2 在基因定点整合中的应用
1.2.3 在基因转录调控中的应用
1.2.4 CRISPR/Cas9技术相比其他基因编辑技术的应用优势
1.3 CRISPR/Cas9的脱靶效应及改进措施的研究
1.4 结语
参考文献
第二章 CRISPR/Cas9表达载体的构建
2.1 材料
2.1.1 主要仪器设备
2.1.2 化学试剂与耗材
2.1.3 实验材料
2.2 方法
2.2.1 靶位点的选取及gRNA的设计
2.2.2 潜在脱靶位点的确定
2.2.3 CRISPR/Cas9骨架载体的构建
2.2.4 靶位点基因PCR引物设计及反应条件优化
2.3 结果
2.3.1 靶位点的选取与sgRNA的确定
2.3.2 脱靶位点的确定
2.3.3 CRISPR/Cas9骨架载体的构建及测序验证
2.3.4 靶位点基因PCR引物设计及条件优化
2.4 讨论
第三章 定点敲除FGF5基因的内蒙古白绒山羊胎儿成纤维细胞系筛选及脱靶位点的验证
3.1 材料
3.1.1 主要仪器设备
3.1.2 化学试剂与耗材
3.1.3 实验材料
3.2 方法
3.2.1 绒山羊胎儿成纤维细胞脂质体转染体系的优化
3.2.2 CRISPR/Cas9表达载体转染绒山羊胎儿成纤维细胞
3.2.3 SURVEYOR酶切活性验证及体系的优化
3.2.4 Surveyor酶切验证转染后的绒山羊胎儿成纤维细胞系pool克隆
3.2.5 测序验证转染后的绒山羊胎儿成纤维细胞系pool克隆
3.2.6 FGF5基因敲除突变单克隆的获得
3.2.7 FGF5基因敲除单克隆测序验证
3.2.8 脱靶位点的验证
3.3 结果
3.3.1 脂质体法转染条件的优化
3.3.2 SURVEYOR酶切活性验证及体系的优化
3.3.3 转染CRISPR/Cas9特异性表达载体后pool克隆Surveyor酶切验证
3.3.4 转染CRISPR/Cas9特异性表达载体后pool克隆测序验证
3.3.5 敲除FGF5基因绒山羊胎儿成纤维细胞阳性单克隆细胞系的获得及鉴定
3.3.6 潜在脱靶位点的验证
3.4 讨论
结论
攻读硕士学位期间所发表的学术论文
致谢
本文编号：3640072
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