两株鸡传染性支气管炎病毒的分离、全基因组测序及其S1基因的克隆表达

发布时间：2022-02-23 02:15

　　鸡传染性支气管炎（Infectious bronchitis,IB）是由鸡传染性支气管炎病毒（infectious bronchitis virus,IBV）感染引起的鸡的一种急性、高度接触性传染病。由于IBV基因组易发生变异和重组,IBV的基因型和血清型复杂多样,且不同血清型间交叉保护性效果不理想。新基因型甚至新血清型不断出现,给IBV的有效防控带来了巨大困难。本研究从疑似IBV感染的IBV免疫鸡群分离鉴定出2株IBV,并对其全基因组进了测序分析以及克隆表达了S1基因。为进一步了解丰富国内IBV流行株的重组变异情况,潜在的免疫逃逸机制以及疫苗毒株筛选依据等积累了数据。1、两株鸡传染性支气管炎病毒的分离与鉴定本研究首先从疑似IBV感染的IBV免疫鸡群采集发病鸡脏器进行鸡胚接种病毒分离。5天后发现接种两个肾脏样品的鸡胚出现典型的卷曲侏儒胚。但其尿囊液不具有血凝现象,以尿囊液提取的RNA反转录的cDNA为模版。用IBV的S基因特异性引物进行了 PCR扩增鉴定,PCR扩增以及序列测序表明能从两个尿囊液样品中扩增出IBV的S基因特异性片段,同时将分离到的这两个毒株分别命名为IBV34以及IBV... 

【文章来源】：扬州大学江苏省

【文章页数】：74 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
符号说明
文献综述
    第一节 鸡传染性支气管炎病毒研究进展
        1.1 鸡传染性支气管炎病毒概况
        1.2 IBV病毒的形态结构与理化特性
        1.3 IBV的流行病学
        1.4 IBV的致病性
        1.5 IBV主要蛋白及其功能
            1.5.1 S蛋白
            1.5.2 M蛋白
            1.5.3 N蛋白
            1.5.4 E蛋白
            1.5.5 非结构蛋白
        1.6 IBV的变异与重组
        1.7 IBV分型
        1.8 IBV的免疫防控
            1.8.1 弱毒疫苗
            1.8.2 灭活疫苗
            1.8.3 核酸疫苗
    第二节 研究目的及意义
研究内容一 两株鸡传染性支气管炎病毒的分离与鉴定
    1 材料
        1.1 主要试验材料
        1.2 主要试剂
        1.3 主要试剂的配制
        1.4 主要仪器
    2 方法
        2.1 病毒的繁殖
        2.2 引物的设计
        2.3 病毒RNA的提取
        2.4 cDNA的制备
        2.5 目的片段的扩增
        2.6 PCR纯化产物的连接和转化
        2.7 连接反应产物转化涂板
        2.8 菌落PCR鉴定
    3. 结果
        3.1 病毒鸡胚接种结果
        3.2 两株IBV病毒与20株IBV参考毒株S1基因序列比较
    4 讨论
研究内容二 两株鸡传染性支气管炎病毒的全基因组测序与分析
    1 材料
        1.1 主要试验材料
        1.2 主要材料
        1.3 主要仪器
        1.4主要仪器
    2 方法
        2.1 病毒的增殖
        2.2 引物的设计
        2.3 病毒RNA的提取
        2.4 cDNA的制备
        2.5 目的片段的扩增
        2.6 PCR纯化产物的连接和转化
        2.7 连接反应产物转化涂板
        2.8 全基因组测序分析
    3 结果
        3.1 IBV34与IBV216两株病毒各个基因片段扩增结果
        3.2 IBV34和IBV216毒株全基因组结构
        3.3 分离株IBV 34基因组的同源重组分析
        3.4 分离株IBV216基因组的同源重组分析
    4 讨论
研究内容三 两株鸡传染性支气管炎病毒S1基因的克隆表达
    1 材料
        1.1 主要试验材料
        1.2 主要试剂
        1.3 主要试剂
        1.4 主要仪器
    2. 方法
        2.1 引物设计与合成
        2.2 RNA的提取
        2.3 cDNA的制备
        2.4 目的片段的扩增
        2.5 RT-PCR产物的胶回收
        2.6 重组质粒的构建
        2.7 重组质粒的鉴定
        2.8 重组蛋白的诱导表达及鉴定
    3 结果
        3.1 两株IBV病毒S1基因片段的扩增及重组子构建
        3.2 重组蛋白GST-S1表达的SDS-PAGE鉴定
        3.3 重组蛋白GST-S1表达的Western-blot鉴定
        3.4 间接免疫荧光鉴定S1蛋白真核表达
    4 讨论
全文总结
参考文献
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]鸡传染性支气管炎病毒HH06株囊膜蛋白多克隆抗体制备及生物学功能检测[J]. 白妍,赵蕾,杜威威,潘龙,黄小丹,杨贵君,李广兴.  中国畜牧兽医. 2016(08)
[2]一株鸡传染性支气管炎病毒的分离和鉴定[J]. 李成元,姚美玲,王广伟,李勇,高见,刘兵.  中兽医学杂志. 2015(07)
[3]鸡传染性支气管炎病毒多表位核酸疫苗的构建及其免疫研究[J]. 刘芳,谭磊,陆凤,范瑾,刘开春,王欣,廖瑛,仇旭升,孙英杰,宋翠萍,王桂军,丁铲.  中国动物传染病学报. 2015(02)
[4]IBV HH06株N基因原核表达及间接ELISA方法的建立[J]. 李广兴,王新,潘龙,杜威威,黄小丹,孙刚,杨贵君,任晓峰.  东北农业大学学报. 2014(05)
[5]禽啄癖分类刍议[J]. 李卫东.  中国兽医杂志. 2013(07)
[6]鸡传染性支气管炎病毒广西分离毒株抗原相关性的研究[J]. 王秀英,李孟,韦平,陈秋英,韦正吉,磨美兰,韦天超.  病毒学报. 2012(06)
[7]传染性支气管炎病毒RT-LAMP检测方法的建立[J]. 范瑾,谭磊,仇旭升,孟春春,包世俊,胡美容,何随彬,郭小琴,于圣青,陈书明,丁铲.  中国兽医科学. 2012(11)
[8]我国鸡传染性支气管炎流行现状及原因分析[J]. 刘胜旺.  中国家禽. 2010(16)
[9]鸡传染性支气管炎病毒免疫机制和免疫预防研究进展[J]. 樊春波,吴建华,艾晓杰.  动物医学进展. 2008(09)
[10]鸡传染性支气管炎病毒中国地方分离株膜蛋白基因的克隆及序列分析[J]. 任涛,廖明,曹伟胜,辛朝安.  中国兽医杂志. 2006(08)

博士论文
[1]2001～2016年间华东地区IBV分子流行病学、致病性及S1蛋白的天然免疫应答研究[D]. 周海生.扬州大学 2017
[2]鸡传染性支气管炎病毒疫苗候选毒株的筛选及评价[D]. 尤永君.中国农业大学 2015
[3]禽传染性支气管炎病毒多表位嵌合DNA疫苗构建及免疫研究[D]. 田浪.四川农业大学 2009



本文编号：3640663