弓形虫SM家族蛋白作为新药物治疗靶点的功能研究

发布时间：2022-02-23 02:37

　　弓形虫是一种专性细胞内寄生顶复门原虫,能够引起人和许多动物的感染。弓形虫包囊被人误食后,会在体内经过缓殖子和速殖子的发育随血液流经全身,从而感染人类。传统的抗弓形虫药物存在副作用大等缺陷,因此急需开发高效的新型治疗药物。最近的研究证明弓形虫具有高度极化的分泌系统,并利用其将蛋白分子分泌到虫体外和宿主细胞中。这些分泌蛋白在弓形虫的入侵和感染建立过程中都具有至关重要的作用。后高尔基体网络承担向虫体质膜、质膜下网络和顶端分泌细胞器分发转运囊泡的运输功能。弓形虫如何完成复杂的囊泡运输尚不清楚。SNARE复合物是囊泡融合的关键复合物,通过形成拉链结构来驱动膜融合。Sec1/Munc18-like（SM）蛋白是调控SNARE复合物的关键元件蛋白。通过生物信息学分析发现弓形虫编码4个SM蛋白（TgVps45、TgSec1、TgVps33以及TgSly1）。本研究通过CRISPR/Cas9基因编辑和植物生长素诱导的蛋白质降解技术（AID）,成功构建了弓形虫TgVps45和TgSec1条件性敲除虫株。通过间接免疫荧光实验发现一部分弓形虫TgVps45蛋白存在于TGN与ELC之间的隔室。TgVps45蛋白... 

【文章来源】：中国农业科学院北京市

【文章页数】：63 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
abstract
第一章 绪论
    1.1 弓形虫及弓形虫病
    1.2 抗弓形虫药物的研究现状
    1.3 弓形虫基因编辑技术
        1.3.1 基因编辑技术的发展
        1.3.2 CRISPR/Cas9 系统在弓形虫基因编辑中的应用
        1.3.3 弓形虫的条件敲除系统
    1.4 弓形虫蛋白的分泌途径
    1.5 SM-SNRAE复合物作为药物靶点的研究现状
    1.6 目的和意义
第二章 TgVps45-TgStx16 复合物作为潜在药物靶点的功能研究
    2.1 实验材料
        2.1.1 主要仪器
        2.1.2 主要材料
    2.2 实验方法
        2.2.1 弓形虫编码SM-SNARE复合物的序列分析
        2.2.2 质粒构建
        2.2.3 单克隆虫株的构建、筛选和鉴定
        2.2.4 间接免疫荧光实验
        2.2.5 弓形虫噬斑实验
        2.2.6 弓形虫入侵水平检测
        2.2.7 弓形虫逸出水平检测
        2.2.8 免疫共沉淀实验
        2.2.9 透射电镜实验
        2.2.10 Brefeldin A处理实验
    2.3 实验结果
        2.3.1 TgSM蛋白序列分析
        2.3.2 TgSNARE蛋白序列分析
        2.3.3 TgVps45条件敲除虫株的构建
        2.3.4 TgStx16条件敲除虫株的构建
        2.3.5 TgVps45蛋白的亚细胞定位
        2.3.6 TgVps45和TgStx16 的相互作用
        2.3.7 TgStx16 蛋白与TgVps45 蛋白的共定位
        2.3.8 TgVps45基因缺失对虫体表型的影响
        2.3.9 TgStx16基因缺失对虫体表型的影响
        2.3.10 电镜观察TgVps45缺失引起的超微结构变化
        2.3.11 TgVps45基因缺失对内膜复合物的影响
        2.3.12 TgVps45基因缺失对后高尔基体转运的影响
        2.3.13 TgVps45基因缺失对分泌性细胞器的影响
        2.3.14 TgStx16基因缺失对内膜复合物的影响
        2.3.15 TgStx16基因缺失对分泌性细胞器的影响
        2.3.16 Brefeldin A对 TgVps45 定位的影响
    2.4 讨论
    2.5 小结
第三章 TgSec1作为潜在药物靶点的功能研究
    3.1 实验材料
        3.1.1 主要仪器
        3.1.2 主要材料
    3.2 实验方法
        3.2.1 质粒构建
        3.2.2 单克隆虫株的构建、筛选和鉴定
        3.2.3 间接免疫荧光实验
        3.2.4 弓形虫噬斑实验
        3.2.5 弓形虫入侵水平检测
        3.2.6 弓形虫复制水平检测
        3.2.7 弓形虫逸出水平检测
        3.2.8 透射电镜实验
        3.2.9 Brefeldin A处理实验
        3.2.10 微线体分泌实验
    3.3 实验结果
        3.3.1 TgSec1条件敲除虫株的构建
        3.3.2 TgSec1蛋白的亚细胞定位
        3.3.3 TgSec1基因缺失对虫体表型的影响
        3.3.4 电镜观察TgSec1缺失引起的超微结构变化
        3.3.5 TgSec1基因缺失对外膜的影响
        3.3.6 TgSec1基因缺失对分泌性细胞器的影响
        3.3.7 Brefeldin A对 TgSec1 定位的影响
        3.3.8 TgSec1微线体分泌实验
    3.4 讨论
    3.5 小结
第四章 全文结论
参考文献
致谢
作者简历



本文编号：3640700