MiRNA抑制山羊副流感病毒3型复制的机制研究

发布时间：2022-02-24 04:57

　　山羊副流感病毒3型（Caprine parainfluenza virus type 3,CPIV3）是副黏病毒科（Paramyxoviridae）呼吸道病毒属（Respirovirus）中的一员,为有囊膜的单股负链RNA病毒。该病毒能通过气溶胶进行水平传播,相邻健康羊只感染后出现与患羊相同的咳嗽、体温升高、流鼻涕、精神沉郁等临床症状。感染羊只可通过多种途径向外排毒,严重感染时可在血液中检出病毒,这为该病的防控增加了难度。研究证实,宿主细胞微小核糖核酸（Micro-ribonucleic acid,miRNA）是宿主-病原体相互作用的复杂网络中不可或缺的调节因子,miRNA通过间接作用于某个细胞成分影响细胞内通路和调节先天性免疫应答,在抗病毒感染和复制方面扮演了重要角色。在前期研究中,将CPIV3接种牛肾细胞（Madin-darby bovine kidney cells,MDBK）后,通过高通量测序技术获得了249个差异表达的miRNA,其中bta-miR-98与bta-miR-222在感染组中下调。GO注释与KEGG富集分析发现,bta-miR-222在抗病毒方面与先天性免疫中有重... 

【文章来源】：贵州大学贵州省211工程院校

【文章页数】：81 页

【学位级别】：硕士

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摘要
Abstract
文献综述
    综述一 副流感病毒3型病原学及其检测方法研究进展
        1. PIV3病原学研究进展
            1.1 PIV3基因组
            1.2 PIV3结构蛋白
            1.3 PIV3基因组复制
        2. PIV3检测方法研究进展
            2.1 PIV3病原学检测
            2.2 PIV3血清学检测
    综述二 MiRNA研究进展
        1. MiRNA的发现与定义
        2. MiRNA识别及靶基因预测
        3. 细胞内源miRNA与副黏病毒相互作用
            3.1 细胞内源miRNA影响副黏病毒免疫反应
            3.2 细胞内源miRNA影响细胞分裂与细胞凋亡
            3.3 细胞内源miRNA影响肿瘤生成
            3.4 细胞内源miRNA对副黏病毒的其他功能
        4. MiRNA与CPIV3
        5. 本研究的目的及意义
试验研究
    第一章 细胞内bta-miR-222 靶向IRF2抑制CPIV3复制的分子机制
        1. 材料
            1.1 细胞与病毒
            1.2 主要试剂
            1.3 主要仪器
        2. 方法
            2.1 Bta-miR-222 mimics和bta-miR-222 inhibitor的设计与合成
            2.2 Bta-miR-222 对CPIV3复制的影响
                2.2.1 荧光定量PCR
                2.2.2 病毒多步生长曲线
            2.3 Bta-miR-222 调控CPIV3复制的分子机制
                2.3.1 Bta-miR-222 对IFN产生的影响
                2.3.2 Bta-miR-222 靶基因预测
                2.3.3 双荧光素酶报告基因系统分析bta-miR-222 靶基因
                2.3.4 荧光定量PCR分析bta-miR-222 靶基因
                2.3.5 Western blot分析bta-miR-222 靶基因蛋白表达水平
                2.3.6 IRF2基因敲除对CPIV3复制的影响
                2.3.7 统计分析
        3. 结果
            3.1 Bta-miR-222 对CPIV3复制的影响
            3.2 Bta-miR-222 对Ⅰ型干扰素表达的影响
            3.3 Bta-miR-222 的靶基因预测
            3.4 双荧光素酶报告基因系统分析bta-miR-222 靶基因
                3.4.1 双荧光素酶报告载体的构建与鉴定
                3.4.2 Bta-miR-222 对IRF2的调控作用
            3.5 敲除IRF2基因对CPIV3复制的影响
        4. 讨论
    第二章 细胞内bta-miR-98 靶向Caspase 3 抑制CPIV3复制的分子机制
        1. 材料
            1.1 细胞与病毒
            1.2 主要试剂
            1.3 主要仪器
        2. 方法
            2.1 CPIV3诱导细胞凋亡的检测
                2.1.0 荧光定量PCR
                2.1.1 Caspase 3/8/9 酶活性检测
                2.1.2 流式细胞术
            2.2 Bta-miR-98 调控细胞凋亡影响CPIV3复制
                2.2.1 Bta-miR-98 mimics和bta-miR-98 inhibitor的设计与合成
                2.2.2 Bta-miR-98 对CPIV3复制的影响
            2.3 Bta-MiR-98 调控细胞凋亡影响CPIV3复制
                2.3.1 Caspase 3 酶活性检测
                2.3.2 流式细胞术
            2.4 Bta-miR-98 调控CPIV3复制的分子机制
                2.4.1 Bta-miR-98 对Caspase 3 产生的影响
                2.4.2 Bta-miR-98 靶基因预测
                2.4.3 双荧光素酶报告基因系统分析bta-miR-98 靶基因
                2.4.4 Caspase 3 基因敲除对CPIV3复制的影响
            2.5 统计分析
        3. 结果
            3.1 CPIV3促进MDBK细胞凋亡
            3.2 Bta-MiR-98 对CPIV3复制的影响
            3.3 Bta-miR-98 靶基因的预测
            3.4 双荧光素酶报告基因系统分析bta-miR-98 靶基因
                3.4.1 双荧光素酶报告载体的构建与鉴定
                3.4.2 Bta-miR-98 对Caspase 3 的调控作用
            3.5 Caspase 3 基因敲除对CPIV3复制的影响
        4. 讨论
    第三章 慢病毒介导的bta-miR-222 稳定过表达MDBK细胞株的构建及鉴定
        1. 材料
            1.1 细胞与病毒
            1.2 主要试剂
            1.3 主要仪器
        2. 方法
            2.1 引物的设计与合成
            2.2 Pri-bta-miR-222 与GFP基因片段的扩增
            2.3 重组PCDH-miR222GFP质粒的构建与鉴定
            2.4 慢病毒V_(PCDH+miR-222)的包装
            2.5 V_(PCDH+miR-222)感染MDBK细胞
            2.6 荧光定量PCR
                2.6.1 细胞miRNA的分离提取与反转录
                2.6.2 荧光定量PCR
        3. 结果
            3.1 重组慢病毒表达质粒的构建与鉴定
            3.3 重组慢病毒的制备
            3.4 稳定表达bta-miR-222 的MDBK细胞株的建立
            3.5 荧光定量PCR
        4. 讨论
全文结论
参考文献
致谢
附录
硕士研究生期间发表论文情况


【参考文献】：
期刊论文
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本文编号：3642023