鸭疫里默氏杆菌转座子随机突变库的构建及毒力相关基因的筛选和鉴定

发布时间：2022-02-24 06:26

　　鸭疫里默氏杆菌病又称鸭传染性浆膜炎,是由鸭疫里默氏杆菌（Riemerella anatipestifer, RA）引起的、危害养鸭业的一种细菌性传染病。目前已有4株RA的全基因组序列在GenBank上公布。RA基因组编码基因约有2000个,但其中仅有少数基因功能已知。构建大规模的随机突变库,是研究RA基因功能的一种重要手段。本研究以鸭疫里默氏杆菌Yb2株为受体菌、携带有质粒pEP4351的大肠杆菌BW19851为供体菌,通过接合转导的方法将质粒pEP4351导入Yb2株中,然后转座子Tn4351随机插入Yb2株的基因组中；再利用Tn4351上的红霉素抗性基因进行阳性接合子的筛选,构建了一个包含约3100个突变株的随机突变文库。计算得转导效率为7.1×10-6。通过接种雏鸭的感染实验对突变株进行了筛选,初筛共获得69株毒力减弱的突变株。利用反向PCR等技术对转座子插入位点的序列进行了测定,获得了27株突变株的转座子插入位点。使用Southern blot对转座子Tn4351插入突变株基因组的次数进行检测,以确定突变株毒力减弱是由于单一的插入突变导致的。在复核过的突变株中,选取了毒力减弱水... 

【文章来源】：安徽农业大学安徽省

【文章页数】：60 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
中文摘要
Abstract
英文缩略表
文献综述
    1. 鸭疫里默氏杆菌研究进展
        1.1 病原概述
        1.2 血清型
        1.3 抗生素耐药性
        1.4 毒力因子研究进展
            1.4.1 外膜蛋白A(OmpA)
            1.4.2 TonB依赖受体1(TonB-dependent receptor 1,TbdR1)
            1.4.3 铁载体相互作用蛋白(SIP)
            1.4.4 明胶酶
            1.4.5 其他潜在的毒力相关因子
    2 转座子诱变
        2.1 转座子诱变技术简介
        2.2 转座子诱变技术的应用
        2.3 信号标签诱变(STM)技术
    3 小结
1 引言
2 材料与方法
    2.1 材料
        2.1.1 菌株和质粒
        2.1.2 实验动物
        2.1.3 培养基
        2.1.4 抗生素
        2.1.5 酶
        2.1.6 其他试剂、试剂盒及感受态
        2.1.7 引物
        2.1.8 主要仪器
    2.2 鸭疫里默氏杆菌Yb2株转座子随机突变库的构建
        2.2.1 细菌培养
        2.2.2 鸭疫里默氏杆菌Yb2株半数致死量(LD_(50))的测定
        2.2.3 卡那霉素和红霉素对鸭疫里默氏杆菌Yb2株最小抑菌浓度的测定
        2.2.4 接合转导
        2.2.5 双重PCR鉴定转座子插入阳性突变株
        2.2.6 突变库的保存
    2.3 毒力减弱突变株的筛选
        2.3.1 初筛
        2.3.2 复核
    2.4 毒力减弱突变株转座子插入位点鉴定
        2.4.1 突变株基因组的提取
        2.4.2 突变株基因组的酶切
        2.4.3 乙醇沉淀法提纯酶切产物
        2.4.4 酶切产物的自连
        2.4.5 反向PCR扩增
        2.4.6 转座子插入位点分析
        2.4.7 Southern blot分析转座子的插入次数
    2.5 突变株Y2666插入失活基因的功能验证
        2.5.1 突变株Y2666基因互补株的构建
        2.5.2 突变株Y2666与基因互补株cY2666的生物学特性
3. 结果
    3.1 鸭疫里默氏杆菌Yb2株的半数致死量
    3.2 卡那霉素和红霉素对鸭疫里默氏杆菌Yb2株最小抑菌浓度的测定
    3.3 随机突变株的鉴定
        3.3.1 双抗培养基筛选
        3.3.2 PCR鉴定
        3.3.3 接合转导效率的计算
    3.4 毒力减弱突变株动物实验筛选结果
        3.4.1 初筛结果
        3.4.2 复核结果
    3.5 毒力减弱突变株转座子插入位点鉴定
        3.5.1 反向PCR结果
        3.5.2 插入位点序列分析结果
    3.6 Southern Blot结果
        3.6.1 突变株基因组酶切
        3.6.2 Southern Blot
    3.7 突变株Y2666基因互补株的构建
        3.7.1 突变株Y2666转座子插入位点分析
        3.7.2 突变株Y2666基因互补株的构建
    3.8 突变株Y2666与基因互补株cY2666的生物学特性
        3.8.1 菌落形态与镜检观察
        3.8.2 血清凝集试验
        3.8.3 生长曲线的绘制
        3.8.4 半数致死量测定
        3.8.5 菌血计数结果
4 讨论
    4.1 突变体库亲本株的选择
    4.2 供体菌和受体菌的培养
    4.3 供体菌和受体菌的数量比例
    4.4 转座子突变体库的保存与复苏
    4.5 筛选毒力减弱突变株的菌量
    4.6 转座子随机突变库的利用潜力
结论
参考文献
致谢
作者简介
在读期间发表的学术论文


【参考文献】：
期刊论文
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[4]血清10型鸭疫里默氏菌4个亚型的分析[J]. 张大丙.  畜牧兽医学报. 2005(02)
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[7]血清4型鸭疫里默氏杆菌在我国的发现及其病原特性研究[J]. 汪铭书,程安春,陈孝跃,刘兆宇,方鹏飞,郭宇飞.  中国兽医杂志. 2002(12)
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本文编号：3642158