山羊溶酶体AMA的定点突变及突变产物对SW敏感性研究
发布时间：2022-02-24 07:24
溶酶体α-甘露糖苷酶（α-mannosidase, AMA）属于糖苷水解酶家族38家族,主要参与N-连接糖蛋白的生物合成及加工折叠过程。疯草是一种主要的有毒植物,含有毒素苦马豆素（swainsonine, SW）,其毒性是SW能够抑制溶酶体AMA,机体低聚糖的新陈代谢发生异常后会大量蓄积在细胞内,从而使细胞发生空泡变性,并由此导致动物中毒死亡,目前还没有彻底治愈疯草中毒的方法。孔祥雅等克隆、表达了山羊溶酶体AMA（chLAM）,应用生物信息学对接分析,确定了降低山羊溶酶体AMA对SW敏感性的定点突变位点。本试验,通过重叠延伸PCR法对山羊溶酶体AMA进行定点突变,构建野生型及突变型酵母重组表达质粒,表达野生型及突变型chLAM重组蛋白,对比突变前后的酶活特性,纯化对SW敏感性降低的表达产物,为预防和治疗家畜疯草中毒,生产疯草中毒的解毒剂提供依据。试验结果如下：1.根据GenBank中提交的山羊LAM序列（JN602369）设计定点突变引物,应用重叠延伸PCR技术对山羊溶酶体α-甘露糖苷酶基因进行定点突变,突变位点为A28Trp→Gly和D58Tyr→Gly位点,获得了具有突变序列的全长...
【文章来源】：西北农林科技大学陕西省211工程院校985工程院校教育部直属院校
【文章页数】：45 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
野生型和突变型C/JLAM基因PCR产物电泳图
物使用目的片段的下游引物His-cMAM R (表2-1 )，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后可见有明显能扩增出目的条带的阳性重组菌落（图3-1，7和9)，图中共显示9个菌落，Ml 2345 6 7 8 9250—100—图3-1菌落PCR蹄选阳性重组表达菌1-6.8.假阳性菌落，7.pPIC9K-dAM重组阳性菌落，9.pPIC9K-c/7LAM-A28-D58重组阳性菌落Fig 3-1 Colony PCR to select positive recombinant plasmid1-6.8. false positive bacterium colony identified by PCR, 7. positive recombinant bacterium colony ofpPIC9K-c7?LAM, 9. positive recombinant bacterium colony of pPIC9K-c7?LAM-A28-D58
(含有Amp终浓度为100 [ig/mD中，37°C过夜培养12 h,提取质粒后取20 ^iL送测序，取2^11^进行￡0)111单酶切鉴定，结果如图3-2，1和2分别代表野生型重组质粒和突变型重组质粒，酶切结果显示两条清晰的条带，即PPIC9K载体条带（图3-2, a),和目的片段条带（图3-2，b)o综合菌落PCR结果，测序结果及EcoRI单酶切结果可以判定野生型和突变型毕赤酵母重组表达质粒构建成功。M 1 2m10000— 7000—4000—L^~D2000—1000—250—图3-2重组表达质粒EcoR I单酶切电泳M. 10000 DNA Marker; I.野生型重组表达质粒，2.突变型重组表达质粒；a.pPIC9K载体片段，b.目的基因片段Fig 3-2 Positive recombinant expression plasmid digested by EcoR IM. 1000 DNA Marker; 1. Wild-type recombinant expression plasmid，2. Mutant-type recombinantexpression plasmid; a. length of vector pPIC9K, b. length of target gene3.3.2重组酵母菌株基因组PCR使用C/jLAM基因的的特异性引物或5’-A0X和3’-AOX通用引物分别以空载pPIC9K重组菌基因组DNA、野生型pPIC9K:-c/2LAM重组菌基因组DNA和突变型pPIC9K-c/zLAM-A28-D58重组菌基因组DNA为模板进行PCR扩增检菌。每个样挑取7个菌落
【参考文献】：
期刊论文
[1]山羊溶酶体α-AMA基因的克隆、生物信息学及组织表达谱分析[J]. 孔祥雅,李义,程敏,荆新堂,李勤凡. 畜牧兽医学报. 2012(05)
[2]脂肪酶及酯酶定点突变研究进展及其应用[J]. 祝玲,周琼,詹冰津,池丽影,张军玲. 海峡药学. 2012(02)
[3]定点突变提高D-氨甲酰水解酶的可溶性表达[J]. 袁野,蔡渊恒,姜世民,姜卫红. 生物技术通报. 2012(01)
[4]苦马豆素抑制α-甘露糖苷酶的剂量效应关系[J]. 孔祥雅,荆新堂,张丽慧,李勤凡,郭伟. 动物医学进展. 2011(01)
[5]重叠延伸PCR法构建VPS4B基因定点突变真核表达载体[J]. 王维鹏,夏剑波,李磊,郝友华,杨东亮. 临床检验杂志. 2011(01)
[6]重叠延伸PCR法构建小鼠Sumf1基因的定点突变真核表达载体[J]. 帅勇,胡兴旺,易朵,王成,赵晓蒙,周畅. 生命科学研究. 2009(05)
[7]Isolation and NMR Study on Swainsonine from Locoweed,Astragalus strictus[J]. ZHAO Bao-yu1,LIU Zhong-yan1,WANG Jian-jun2,SUN Li-sha1,WANG Zhan-xin1 and WANG Yin-chao1,3 1 College of Veterinary Medicine,Northwest A & F University,Yangling 712100,P.R.China 2 Xi’an Municipal Public Security Bureau,Xi’an 710000,P.R.China 2 Kunming Institute of Botany,Chinese Academy of Sciences,Kunming 650204,P.R.China. Agricultural Sciences in China. 2009(01)
[8]中国西部草地毒草危害及治理对策[J]. 赵宝玉,刘忠艳,万学攀,霍星华,郭玺,王建军,刘忠艳,孙莉莎,史志诚. 中国农业科学. 2008(10)
[9]α-甘露糖苷酶研究进展[J]. 刘红霞,苏卫,张连峰. 中国比较医学杂志. 2006(11)
[10]绵羊血清α甘露糖苷酶活性测定[J]. 樊泽峰,赵宝玉,李明涛,樊月圆,王建军. 动物医学进展. 2005(12)
本文编号：3642253
【文章来源】：西北农林科技大学陕西省211工程院校985工程院校教育部直属院校
【文章页数】：45 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
野生型和突变型C/JLAM基因PCR产物电泳图
物使用目的片段的下游引物His-cMAM R (表2-1 )，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后可见有明显能扩增出目的条带的阳性重组菌落（图3-1，7和9)，图中共显示9个菌落，Ml 2345 6 7 8 9250—100—图3-1菌落PCR蹄选阳性重组表达菌1-6.8.假阳性菌落，7.pPIC9K-dAM重组阳性菌落，9.pPIC9K-c/7LAM-A28-D58重组阳性菌落Fig 3-1 Colony PCR to select positive recombinant plasmid1-6.8. false positive bacterium colony identified by PCR, 7. positive recombinant bacterium colony ofpPIC9K-c7?LAM, 9. positive recombinant bacterium colony of pPIC9K-c7?LAM-A28-D58
(含有Amp终浓度为100 [ig/mD中，37°C过夜培养12 h,提取质粒后取20 ^iL送测序，取2^11^进行￡0)111单酶切鉴定，结果如图3-2，1和2分别代表野生型重组质粒和突变型重组质粒，酶切结果显示两条清晰的条带，即PPIC9K载体条带（图3-2, a),和目的片段条带（图3-2，b)o综合菌落PCR结果，测序结果及EcoRI单酶切结果可以判定野生型和突变型毕赤酵母重组表达质粒构建成功。M 1 2m10000— 7000—4000—L^~D2000—1000—250—图3-2重组表达质粒EcoR I单酶切电泳M. 10000 DNA Marker; I.野生型重组表达质粒，2.突变型重组表达质粒；a.pPIC9K载体片段，b.目的基因片段Fig 3-2 Positive recombinant expression plasmid digested by EcoR IM. 1000 DNA Marker; 1. Wild-type recombinant expression plasmid，2. Mutant-type recombinantexpression plasmid; a. length of vector pPIC9K, b. length of target gene3.3.2重组酵母菌株基因组PCR使用C/jLAM基因的的特异性引物或5’-A0X和3’-AOX通用引物分别以空载pPIC9K重组菌基因组DNA、野生型pPIC9K:-c/2LAM重组菌基因组DNA和突变型pPIC9K-c/zLAM-A28-D58重组菌基因组DNA为模板进行PCR扩增检菌。每个样挑取7个菌落
【参考文献】：
期刊论文
[1]山羊溶酶体α-AMA基因的克隆、生物信息学及组织表达谱分析[J]. 孔祥雅,李义,程敏,荆新堂,李勤凡. 畜牧兽医学报. 2012(05)
[2]脂肪酶及酯酶定点突变研究进展及其应用[J]. 祝玲,周琼,詹冰津,池丽影,张军玲. 海峡药学. 2012(02)
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[4]苦马豆素抑制α-甘露糖苷酶的剂量效应关系[J]. 孔祥雅,荆新堂,张丽慧,李勤凡,郭伟. 动物医学进展. 2011(01)
[5]重叠延伸PCR法构建VPS4B基因定点突变真核表达载体[J]. 王维鹏,夏剑波,李磊,郝友华,杨东亮. 临床检验杂志. 2011(01)
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[7]Isolation and NMR Study on Swainsonine from Locoweed,Astragalus strictus[J]. ZHAO Bao-yu1,LIU Zhong-yan1,WANG Jian-jun2,SUN Li-sha1,WANG Zhan-xin1 and WANG Yin-chao1,3 1 College of Veterinary Medicine,Northwest A & F University,Yangling 712100,P.R.China 2 Xi’an Municipal Public Security Bureau,Xi’an 710000,P.R.China 2 Kunming Institute of Botany,Chinese Academy of Sciences,Kunming 650204,P.R.China. Agricultural Sciences in China. 2009(01)
[8]中国西部草地毒草危害及治理对策[J]. 赵宝玉,刘忠艳,万学攀,霍星华,郭玺,王建军,刘忠艳,孙莉莎,史志诚. 中国农业科学. 2008(10)
[9]α-甘露糖苷酶研究进展[J]. 刘红霞,苏卫,张连峰. 中国比较医学杂志. 2006(11)
[10]绵羊血清α甘露糖苷酶活性测定[J]. 樊泽峰,赵宝玉,李明涛,樊月圆,王建军. 动物医学进展. 2005(12)
本文编号：3642253
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