沙门菌H:g单抗竞争ELISA方法的建立与应用

发布时间：2022-02-24 17:03

　　沙门菌是一种常见的人兽共患致病菌,给养殖业带来了巨大的损失。流行病学研究表明,国内规模化养鸡场沙门菌感染的优势血清型是肠炎沙门菌和鸡白痢沙门菌。本实验室前期建立的检测D群沙门菌抗体的O9单抗竞争ELISA方法虽然可以快速、高效地检测这两种沙门菌感染,但无法进一步区分。研究表明,基于H抗原特异性抗体的检测方法可以解决这一难题。因此,本研究在已有肠炎沙门菌H:g抗原单抗的基础上,通过条件的优化,建立了快速检测肠炎沙门菌抗体的竞争ELISA方法。并且发现,该方法与O9单抗竞争ELISA的联合使用,可以有效鉴别区分鸡白痢沙门菌的感染,为鸡白痢沙门菌净化提供技术支撑。1.沙门菌H:g抗原单抗竞争ELISA方法的建立以本实验室制备的12E3杂交瘤细胞制备腹水单抗,经纯化标记后,其效价为32000。同时,应用酸解法提取肠炎沙门菌鞭毛蛋白作为包被抗原。采用方阵滴定法确定竞争ELISA方法中抗原的最适包被浓度为5.8 μg/mL,酶标抗体的最适使用浓度为0.5 μg/mL。在此基础上,确定待测血清的最适稀释度为1:8。经过一系列实验条件的优化,确定检测条件:以PBS作为抗原包被液,4℃包被20h;以含5... 

【文章来源】：扬州大学江苏省

【文章页数】：78 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
符号说明
文献综述 家禽肠炎沙门菌研究进展
    1 流行病学
    2 致病性和感染机制
    3 SE检测方法
        3.1 微生物学检测方法
        3.2 免疫学检测方法
        3.3 分子生物学检测方法
    4 展望
第一章 沙门菌H:g抗原单克隆抗体竞争ELISA方法的建立
    1 材料
        1.1 菌株
        1.2 生物材料
        1.3 主要试剂
        1.4 主要仪器和耗材
        1.5 实验动物
    2 方法
        2.1 杂交瘤细胞的复苏
        2.2 小鼠腹水的制备
        2.3 小鼠腹水的纯化与标记
        2.4 肠炎沙门菌鞭毛蛋白的提取与纯化
        2.5 最适抗原包被浓度与酶标抗体浓度的确定
        2.6 最适血清稀释倍数的确定
        2.7 最适抗原包被液的确定
        2.8 最适包被条件的确定
        2.9 最适封闭液的确定
        2.10 最适封闭时间的确定
        2.11 酶标抗体最适孵育时间的确定
        2.12 最适显色时间的确定
        2.13 最适抗原包被浓度和酶标抗体浓度的优化
        2.14 H:g单抗竞争ELISA方法阈值的确定
        2.15 H:g单抗竞争ELISA方法检测限的确定
        2.16 H:g单抗竞争ELISA方法的特异性和敏感性测定
        2.17 H:g单抗竞争ELISA方法的重复性测定
        2.18 统计学分析
    3 结果
        3.1 单抗纯化与标记结果
        3.2 鞭毛蛋白的提取分析结果
        3.3 最适抗原包被浓度与酶标抗体浓度的分析结果
        3.4 最适血清稀释度的分析结果
        3.5 最适包被液分析结果
        3.6 最适包被条件分析结果
        3.7 最适封闭液分析结果
        3.8 最适封闭时间分析结果
        3.9 酶标抗体最适孵育时间分析结果
        3.10 最适显色时间分析结果
        3.11 抗原包被浓度与酶标抗体稀释度的优化分析结果
        3.12 H:g单抗竞争ELISA阈值分析结果
        3.13 H:g单抗竞争ELISA检测限分析结果
        3.14 H:g单抗竞争ELISA的特异性和敏感性测定结果
        3.15 重复性实验分析结果
    4 讨论
第二章 沙门菌H:g单抗竞争ELISA试剂盒的组装与应用
    1 材料
        1.1 生物材料
        1.2 被检样品
        1.3 主要试剂
        1.4 主要仪器和耗材
        1.5 实验动物
    2 方法
        2.1 酶标抗体保护剂的选择
        2.2 热稳定性实验
        2.3 H:g单抗竞争ELISA试剂盒的组装
        2.4 H:g单抗竞争ELISA试剂盒的保存稳定性实验
        2.5 H:g单抗竞争ELISA试剂盒的质量检验
        2.6 H:g单抗竞争ELISA试剂盒的单盲检测实验
        2.7 H:g单抗竞争ELISA试剂盒的适用性实验
        2.8 H:g单抗竞争ELISA试剂盒在检测养殖场临床样品中的应用
        2.9 H:g单抗竞争ELISA试剂盒与O9单抗竞争ELISA试剂盒的联用
        2.10 统计学分析
    3 结果
        3.1 保护剂保护效果的分析结果
        3.2 包被有鞭毛蛋白的固相载体的热稳定性分析结果
        3.3 酶标抗体的热稳定性分析结果
        3.4 阴、阳性对照和空白对照血清的热稳定性分析结果
        3.5 H:g单抗竞争ELISA试剂盒的组装结果
        3.6 H:g单抗竞争ELISA试剂盒的稳定性分析结果
        3.7 H:g单抗竞争ELISA试剂盒的质量检验结果
        3.8 H:g单抗竞争ELISA试剂盒的单盲检测结果
        3.9 H:g单抗竞争ELISA试剂盒与商品化试剂盒的比较结果
        3.10 H:g单抗竞争ELISA与PAT的比较结果
        3.11 不同养殖场临床样品的检测结果
        3.12 养殖场不同月份临床样品的检测结果
        3.13 H:g单抗竞争ELISA试剂盒与O9单抗竞争ELISA试剂盒的联用结果
    4 讨论
全文总结
参考文献
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]新杨黑与苏禽绿壳蛋鸡鸡白痢的检测与净化研究[J]. 蔡丙严,田其真,郝福星,张玲,戴建华.  畜禽业. 2019(08)
[2]食品中沙门氏菌检测现状分析[J]. 李惠静.  现代食品. 2019(09)
[3]双抗原夹心ELISA法检测抗念珠菌烯醇化酶抗体[J]. 汪俊,吴福珍,焦继光.  海南医学. 2018(13)
[4]我国部分地区鸡、猪源沙门氏菌血清型与耐药性比较[J]. 李月华,赵建梅,张青青,曲志娜.  中国动物检疫. 2018(06)
[5]中国四省份规模化肉鸡生产全过程沙门菌的污染状况和耐药特征研究[J]. 李薇薇,白莉,张秀丽,遇晓杰,唐震,毕振旺,郭云昌.  中华预防医学杂志. 2018 (04)
[6]种鸡场沙门菌血清学与病原学监测结果比较与分析[J]. 刘洋,王传彬,霍斯琪,刘玉良,张倩,顾小雪.  中国兽医杂志. 2018(02)
[7]鸡白痢沙门氏菌胶体金免疫层析快速检测试纸条的研制及初步应用[J]. 刘志科,杨宁宁,徐明国,荆明龙,曹旭东,陈创夫.  河南科技学院学报(自然科学版). 2018(01)
[8]食源性沙门菌PCR检测方法的建立[J]. 刘绪平,李景莲,熊骏,姜鹏超,蒋双勤,刘卫德.  中国卫生检验杂志. 2017(24)
[9]乳粉中金黄色葡萄球菌与沙门氏菌定性检测能力验证结果与分析[J]. 叶玉华.  食品安全导刊. 2017(30)
[10]肠炎沙门菌感染ICR小鼠模型的建立[J]. 王伟,尹海畅,吕兴峰,刘思国,陈洪岩,孟庆文.  中国兽医科学. 2017(10)

硕士论文
[1]沙门菌O9抗原单克隆抗体竞争ELISA试剂盒的研制及初步应用[D]. 耿浩鹏.扬州大学 2018
[2]鸡白痢/鸡伤寒诊断方法的建立与初步应用[D]. 许莹.扬州大学 2018
[3]我国部分地区种鸡场沙门菌流行现状调查、耐药性分析及分子分型[D]. 费晓.扬州大学 2017
[4]江苏地区禽源沙门菌的临床检测及相关特性的分析[D]. 赵方.扬州大学 2016
[5]水溶性多色量子点的合成及其作为纳米荧光探针在蛋品安全检测方面的应用研究[D]. 王蓓蓓.华中农业大学 2014
[6]一株鸡源性肠炎沙门氏菌MLST分型及三型分泌系统基因分析[D]. 王涛.山东农业大学 2012
[7]小反刍兽疫间接ELISA检测方法的优化及其应用[D]. 陆则基.扬州大学 2009



本文编号：3643157