miR-34b通过靶向SYISL调节成肌细胞增殖和分化

发布时间：2022-02-24 18:04

　　在畜牧生产中,骨骼肌生长发育及品质性状是评价产肉动物产肉性能的重要指标。在骨骼肌发育的调控网络中,非编码基因起着相当重要的调控作用,如目前研究较多的microRNA和lncRNA。本实验室前期发现长链非编码RNA-SYISL能够促进成肌细胞增殖,抑制成肌细胞分化。基于此,本研究通过生物信息学分析,预测miR-34b能够结合SYISL,首先利用对miR-34b的抑制和过表达技术研究了miR-34b对成肌细胞增殖和分化的影响,进一步的研究发现miR-34b可通过靶向SYISL来调控成肌细胞增殖和分化,具体的研究结果如下:1.利用荧光定量PCR技术研究了miR-34b在小鼠不同组织中的表达情况,发现miR-34b在腿肌中高表达,且在C2C12细胞分化过程中表达量逐渐上升。利用荧光定量PCR、Western Blot和细胞免疫荧光技术研究了抑制和过表达miR-34b后对成肌细胞增殖和分化相关基因影响,结果表明miR-34b抑制成肌细胞增殖,促进成肌细胞分化。2.利用生物信息学分析、双荧光素酶报告载体实验、RNA pull-down实验和RNA结合蛋白免疫沉淀（RNA Binding Prote... 

【文章来源】：华中农业大学湖北省211工程院校教育部直属院校

【文章页数】：78 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
缩略词表
第一章 文献综述
    1 骨骼肌生长发育及调控
        1.1 骨骼肌的生长发育起源
        1.2 骨骼肌增殖和分化的调控过程
    2 非编码RNA特征及其在肌肉生长发育过程中的功能
        2.1 非编码RNA的分类
        2.2 MicroRNA
            2.2.1 MicroRNA的生物发生
            2.2.2 MicroRNA的作用机制
            2.2.3 MicroRNA在肌肉发育中的作用
            2.2.4 MiR-34 家族简介
        2.3 长链非编码RNA(lncRNA)
            2.3.1 LncRNA的基本特征
            2.3.2 LncRNA与肌肉的生长发育
        2.4 MicroRNA的研究方法
    3 本研究的目的与意义
第二章 材料与方法
    1 实验材料
        1.1 细胞与动物
        1.2 菌株和载体
        1.3 主要试剂和试剂盒
        1.4 常用试剂及配制
        1.5 主要仪器和设备
        1.6 应用的分析软件和生物信息学网站
    2 试验方法
        2.1 构建小鼠组织表达谱
            2.1.1 小鼠组织样总RNA提取
            2.1.2 RNA浓度和纯度检测
            2.1.3 RNA反转录成c DNA
            2.1.4 MiRNA茎环DNA的反转录
        2.2 细胞培养
            2.2.1 细胞复苏
            2.2.2 细胞冻存
            2.2.3 细胞的增殖培养
            2.2.4 细胞的分化培养
        2.3 MiR-34b抑制剂和模拟物的设计合成
        2.4 SYISL双荧光素酶报告基因载体的构建
            2.4.1 SYISL cDNA的克隆
            2.4.2 琼脂糖凝胶电泳和成像
            2.4.3 PCR产物的回收和克隆测序
        2.5 pmirGLO-SYISL突变载体的构建
        2.6 细胞转染
            2.6.1 脂质体介导的微小RNA和超表达质粒的转染
            2.6.2 脂质体介导的SYISL双荧光载体细胞转染及双荧光测定
        2.7 细胞总RNA提取和c DNA制备
        2.8 荧光定量PCR
            2.8.1 荧光定量PCR体系
            2.8.2 定量数据分析
            2.8.3 荧光定量PCR引物
        2.9 细胞和组织蛋白提取及浓度测定
        2.10 Western Blot实验
            2.10.1 SDS-PAGE凝胶制备
            2.10.2 SDS-PAGE凝胶电泳
            2.10.3 转膜
            2.10.4 抗原抗体免疫反应
            2.10.5 ECL化学发光检测
        2.11 EdU染色
        2.12 免疫荧光分析
        2.13 RNA免疫沉淀(RIP)
            2.13.1 裂解产物的准备
            2.13.2 磁珠的准备
            2.13.3 RNA沉淀反应
            2.13.4 RNA的纯化
            2.13.5 cDNA的合成
        2.14 RNA pull-down实验
            2.14.1 SYISL基因体外转录载体构建
            2.14.2 SYISL基因体外转录
        2.15 数据统计与分析
第三章 结果与分析
    1 MiR-34b的组织表达谱
    2 MiR-34b在成肌细胞不同分化时期的表达情况
    3 MiR-34b对成肌细胞增殖的影响
        3.1 MiR-34b inhibitor对 miR-34b的抑制效率检测
        3.2 抑制miR-34b对成肌细胞增殖的影响
        3.3 过表达miR-34b对成肌细胞增殖的影响
    4 MiR-34b对成肌细胞分化的影响
        4.1 抑制miR-34b对成肌细胞分化的影响
        4.2 过表达miR-34b对成肌分化的影响
    5 MiR-34b对 SYISL的影响
        5.1 生物信息学预测miR-34b可靶向SYISL
        5.2 SYISL双荧光素酶报告载体的构建和鉴定
        5.3 在C2C12和Hela细胞中验证miR-34b与 SYISL结合
        5.4 体外实验验证miR-34b可直接与SYISL和 AGO2 结合
        5.5 miR-34b下调SYISL的表达量
    6 MiR-34b通过靶向SYISL调节成肌细胞增殖和分化
    7 MiR-34b促进SYNPO2 的表达
第四章 讨论
    1 MiR-34b靶向SYISL
    2 MiR-34b在成肌细胞增殖和分化过程中的功能
    3 MiR-34b通过靶向SYISL调节成肌细胞增殖和分化
    4 MiR-34b对 SYNPO2 基因表达的影响
第五章 小结
    1 本研究主要结论
    2 主要创新点
    3 下一步计划
参考文献
致谢



本文编号：3643249