福建省部分猪场等孢球虫感染的调查及其PCR和LAMP检测方法的建立

发布时间：2022-05-08 18:07

　　猪等孢球虫主要寄生于空肠与回肠,可致三周龄以内的哺乳仔猪出现腹泻和体重下降等临床症状,常给养殖户的经济利益带来巨大的损害。在福建省9个地区的29个猪场,检测1-8周龄仔猪粪便样品2173份,检测结果为:存在猪等孢球虫（Isospora suis）的阳性场28个,占检测猪场数的96.56%;猪等孢球虫卵囊总阳性率为9.76%（212/2173）。不同猪场间仔猪等孢球虫卵囊阳性率最高为27.78%,阳性猪每克粪便卵囊数（OPG值）在25～115100之间;卵囊阳性率与对数化的OPG值呈显著正相关（R=0.445,P=0.016）。福建省沿海六个地区的平均气温与猪等孢球虫的卵囊阳性率呈显著正相关（R=0.937,P=0.006）。第1周龄至第8周龄仔猪等孢球虫卵囊阳性率2.66%～17.46%;2周龄仔猪的OPG值显著高于其它周龄仔猪（P<0.01）;3周龄仔猪的阳性率显著高于其他周龄（P<0.01）。不使用抗球虫药物与使用其它抗球虫药的猪场,其仔猪等孢球虫阳性率、OPG值均显著高于使用百球清的猪场（P<0.01,P<0.05）。另外发现,高床垫料饲养育成猪的等孢球虫... 

【文章页数】：68 页

【学位级别】：硕士

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摘要
Abstract
第一章 文献综述
    1 猪等孢球虫概述
        1.1 猪等孢球虫的分类及生物学特征
            1.1.1 猪等孢球虫的分类
            1.1.2 猪等孢球虫的形态特征
            1.1.3 猪等孢球虫的生活史
    2 球虫卵囊的分离方法
        2.1 粪便中分离球虫卵囊的主要方法
            2.1.1 饱和盐水漂浮法
            2.1.2 Sheather's蔗糖溶液漂浮法
        2.2 组织中分离球虫卵囊的主要方法
            2.2.1 饱和硫酸镁溶液漂浮法
            2.2.2 改良韦氏法(浓硫酸-重铬酸钠卵囊洗液处理法)
        2.3 单卵囊分离的主要方法
            2.3.1 玻璃毛细吸管分离法
            2.3.2 琼脂分离法
            2.3.3 玻璃纸分离法
    3 猪球虫的分子生物学诊断方法
        3.1 酶联免疫吸附检测法(ELISA检测法)
        3.2 自体荧光显微镜检测技术
        3.3 PCR技术
            3.3.1 普通PCR
            3.3.2 巢式PCR(Nested PCR)
            3.3.3 聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)
        3.4 LAMP技术
            3.4.1 LAMP技术的原理
            3.4.2 LAMP扩增产物的检测方法
            3.4.3 LAMP技术与PCR技术的比较
            3.4.4 LAMP检测方法在寄生虫学上的应用及展望
        3.5 本试验的研究目的及意义
第二章 福建省部分猪场猪等孢球虫感染情况的调查与分析
    1 材料与方法
        1.1 样品的采集
        1.2 卵囊检查及鉴定
        1.3 OPG值测定
        1.4 统计方法
    2 结果与分析
        2.1 总体检测情况
        2.2 不同猪场仔猪等孢球虫的感染情况
        2.3 仔猪等孢球虫卵囊阳性率与感染强度的关系
        2.4 猪场规模对仔猪等孢球虫感染的影响
        2.5 仔猪等孢球虫感染的地区差异
        2.6 仔猪等孢球虫感染的周龄差异
        2.7 不同饲养地面对猪感染等孢球虫的影响
        2.8 抗球虫药物对仔猪感染等孢球虫的影响
            2.8.1 不同猪场间的比较
            2.8.2 不同周龄仔猪的比较
    3 小结与讨论
第三章 猪等孢球虫的PCR诊断方法
    1 材料与方法
        1.1 材料
            1.1.1 虫株与菌株
            1.1.2 主要试剂
            1.1.3 主要仪器
        1.2 方法
            1.2.1 卵囊的收集与纯化
            1.2.2 卵囊DNA提取
            1.2.3 目的基因的PCR扩增
            1.2.4 目的基因的克隆
            1.2.5 敏感性试验
            1.2.6 特异性试验
            1.2.7 临床中特定个数卵囊的PCR检测
    2 结果及分析
        2.1 PCR反应温度的优化
        2.2 PCR反应模板DNA量的优化
        2.3 PCR反应引物浓度的优化
        2.4 重组质粒的双酶切鉴定
        2.5 重组质粒测序结果
        2.6 PCR特异性试验
        2.7 PCR敏感性试验
        2.8 临床中特定个数卵囊PCR的检测结果
    3 小结与讨论
        3.1 猪等孢球虫卵囊DNA提取方法的优化
        3.2 PCR反应体系的优化
        3.3 质粒及卵囊检测阀值的确定
第四章 猪等孢球虫LAMP检测方法的建立
    1 材料与方法
        1.1 材料
            1.1.1 虫株与菌株
            1.1.2 主要试剂
            1.1.3 主要仪器
        1.2 方法
            1.2.1 猪等孢球虫卵囊的收集与纯化
            1.2.2 猪等孢球虫卵囊DNA的提取
            1.2.3 目的基因的LAMP扩增
            1.2.4 特异性试验
            1.2.5 敏感性试验
            1.2.6 临床中特定个数卵囊的LAMP检测
    2 结果及分析
        2.1 LAMP反应Bst DNA聚合酶浓度的优化结果
        2.2 LAMP反应Mg~(2+)浓度的优化结果
        2.3 LAMP反应dNTPs浓度的优化结果
        2.4 LAMP反应甜菜碱浓度的优化结果
        2.5 LAMP反应内引物的优化结果
        2.6 LAMP特异性试验
        2.7 LAMP敏感性试验
        2.8 临床中特定个数卵囊DNA的LAMP检测
    3 小结与讨论
        3.1 猪等孢球虫LAMP检测方法的建立及优化
        3.2 LAMP技术与PCR技术敏感性的比较
        3.3 LAMP技术污染的控制
本论文结论与创新点
参考文献
致谢
附表1
附图1
攻读学位期间承担的科研任务与主要成果


【参考文献】：
期刊论文
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[2]微小隐孢子虫LAMP检测方法的探索[J]. 史亚东,董海聚,王荣军,张龙现,宁长申,菅复春.  中国人兽共患病学报. 2012(12)
[3]酶联免疫吸附检测法的应用研究进展[J]. 伏旭,李培武,贺莉,尹稳,傅仲学.  氨基酸和生物资源. 2012(03)
[4]湖南省猪球虫种类及感染状况研究[J]. 伍慧兰.  湘南学院学报. 2011(05)
[5]福建省部分规模化猪场球虫感染情况调查[J]. 张世忠,江斌,吴胜会,林琳.  养猪. 2011(02)
[6]猪等孢球虫的分离、分子生物学初步鉴定及PCR诊断方法的建立[J]. 刘锦,梁全顺.  福建畜牧兽医. 2010(04)
[7]环介导等温扩增技术在畜禽疾病诊断中的应用[J]. 刘宝山,潘树德,尹荣焕,沈国顺.  中国兽医杂志. 2009(07)
[8]云南省昆明市猪球虫种类的初步调查[J]. 廖洁颖,胡俊杰.  畜牧与兽医. 2008(09)
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硕士论文
[1]福建省猪主要寄生虫流行现状研究[D]. 刘锦.福建农林大学 2010
[2]LAMP和PCR检测单核细胞增生性李斯特氏菌的研究[D]. 张亚爽.河北农业大学 2008
[3]艾美耳球虫卵囊染色方法筛选及PCR扩增方法的建立[D]. 李娜.河南农业大学 2007



本文编号：3652127