牛DEC1基因抑制肌卫星细胞和脂肪细胞分化
发布时间：2022-07-03 15:55
胚胎软骨分化因子1(（Differentiated embryo-chondrocyte1, DEC1）是bHLH家族成员之一,参与体内神经生成、肿瘤生成、软骨发育、低氧应激和代谢综合症发生等多个过程。近来,有研究发现DEC1在肌肉发育和脂肪沉积方面同时发挥着重要作用,而肌肉发育和脂肪沉积是肉用家畜最重要的两个性状。因此,DEC1基因很可能是影响肉牛经济性状的重要遗传标记基因,而其影响肌肉发育和脂肪沉积的分子机制研究也非常必要。基于此,本研究利用荧光定量PCR、基因克隆、腺病毒包装、Western blot、细胞免疫荧光、细胞培养以及双荧光素酶报告系统等实验技术,综合分析了牛DEC1在肌肉发育和脂肪生成中的作用及其分子机制,研究内容包括牛骨骼肌卫星细胞的分离培养及鉴定,牛DEC1基因在不同组织及肌卫星细胞分化过程中表达模式分析,DEC1诱导剂CoCl2对牛肌卫星细胞分化的影响,牛DEC1基因的克隆及对牛肌卫星细胞分化的调控,牛MyoG基因启动子活性分析及DEC1对MyoG启动子活性的调控,过表达DEC1对脂肪细胞分化的影响及其调控机制,牛DEC1基因多态性及其与生长性状的关联分析。本研...
【文章页数】：115 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
文献综述
第一章 肌肉卫星细胞起源及其调控机制
1.1 肌肉卫星细胞的特性与来源
1.2 影响肌肉卫星细胞分化的转录调控
1.2.1 盒转录因子3
1.2.2 盒转录因子7
1.2.3 Myf5和MyoD
1.2.4 MyoG和MRF4
1.3 影响肌肉卫星细胞分化的其它因素
1.3.1 Notch通路
1.3.2 MiRNAs
1.3.3 低氧环境应激(Hypoxia)
1.3.4 细胞之间的互作
第二章 脂肪细胞的起源及其调控机制
2.1 脂肪的起源与形成过程
2.1.1 脂肪的起源
2.1.2 脂肪细胞分化过程
2.2 脂肪细胞分化的重要转录调控因子
2.2.1 PPARg
2.2.2 KLFs
2.2.3 SREBPs
2.2.4 C/EBP
第三章 DEC1的分子特性及对肌肉发育和脂肪沉积的调控
3.1 bHLH蛋白的分类
3.2 DEC1的分子特性与生理功能
3.2.1 DEC1基因的分子特性
3.2.2 DEC1与DEC2
3.2.3 DEC1基因的结构与生理功能
3.3 DEC1参与肌肉再生和肌肉发育调控
3.4 DEC1调控脂肪细胞分化
实验研究
第四章 牛骨骼肌卫星细胞的分离培养及鉴定
4.1 材料与方法
4.1.1 试验动物
4.1.2 试验试剂和材料
4.1.3 牛骨骼肌卫星细胞的分离
4.1.4 牛骨骼肌卫星细胞的培养与传代
4.1.5 牛骨骼肌卫星细胞的免疫荧光鉴定
4.2 结果与分析
4.2.1 牛骨骼肌卫星细胞最佳消化分离方法
4.2.2 牛骨骼肌卫星细胞的诱导分化
4.2.3 牛骨骼肌卫星细胞的细胞免疫荧光鉴定
4.3 讨论
4.4 小结
第五章 牛DEC1基因在不同组织及肌卫星细胞分化过程中表达模式分析
5.1 材料与方法
5.1.1 试验动物与组织样品的采取
5.1.2 试验试剂和材料
5.1.3 牛骨骼肌细胞的分离培养及诱导分化
5.1.4 组织和细胞RNA的提取和反转录cDNA的合成
5.1.5 荧光定量PCR检测
5.1.6 试验数据统计与分析
5.2 结果与分析
5.2.1 DEC1在牛不同发育阶段各组织的表达差异
5.2.2 DEC1在牛肌卫星细胞分化过程中的表达模式分析
5.3 讨论
5.4 小结
第六章 COCl_2诱导DEC1表达同时抑制牛肌卫星细胞分化
6.1 材料与方法
6.1.1 试验试剂
6.1.2 牛骨骼肌卫星细胞的分离培养及诱导分化
6.1.3 细胞总RNA的提取和反转录cDNA的合成
6.1.4 荧光定量PCR检测
6.1.5 Western-blot检测
6.1.6 细胞免疫荧光染色检测
6.1.7 试验数据统计与分析
6.2 结果与分析
6.2.1 在牛肌卫星细胞生长培养基中添加COCl_2对相关基因mRNA表达的调控
6.2.2 在牛肌卫星细胞诱导分化过程中添加COCl_2对相关基因mRNA表达的调控
6.2.3 Western blot检测在牛肌卫星细胞诱导分化过程中添加CoCl_2对MyoG基因蛋白水平表达的调控
6.2.4 细胞免疫荧光检测在牛肌卫星细胞诱导分化过程中添加CoCl_2对MyoG基因蛋白水平表达的调控
6.3 讨论
6.4 小结
第七章 牛DEC1基因的克隆及对肌卫星细胞分化的调控
7.1 材料与方法
7.1.1 试验材料与试剂
7.1.2 牛DEC1基因CDS区的克隆
7.1.3 牛DEC1过表达载体构建与腺病毒包装
7.1.4 DEC1重组腺病毒感染牛肌卫星细胞
7.1.5 实时定量PCR检测
7.1.6 Western blot检测
7.1.7 细胞免疫荧光检测
7.1.8 试验数据统计与分析
7.2 结果与分析
7.2.1 牛DEC1基因的克隆与序列分析
7.2.2 穿梭载体pAdTrack-CMV-DEC1和骨架载体pAd-Easy-DEC1的构建
7.2.3 DEC1过表达腺病毒的包装与扩繁
7.2.4 DEC1过表达腺病毒的鉴定
7.2.5 在普通生长培养基状态下DEC1过表达腺病毒感染牛肌卫星细胞相关基因的mRNA表达量
7.2.6 在诱导分化状态下DEC1过表达腺病毒感染牛肌卫星细胞后细胞形态差异
7.2.7 Western blot检测在诱导分化状态下DEC1过表达腺病毒感染牛肌卫星细胞后MyoG的表达
7.2.8 细胞免疫荧光检测在诱导分化状态下DEC1过表达腺病毒感染牛卫星细胞后MyoG的表达
7.3 讨论
7.4 小结
第八章 牛MyoG基因启动子活性分析及DEC1对MyoG启动子活性的调控
8.1 材料与方法
8.1.1 试验材料与试剂
8.1.2 MyoG启动子片段的克隆
8.1.3 MyoG启动子不同缺失片段pGL3-MyoGpro载体的构建
8.1.4 DEC1过表达载体pcDNA3.1-DEC1载体的构建
8.1.5 MyoG启动子不同缺失片段转录活性的测定
8.1.6 DEC1过表达时MyoG启动子转录活性的测定
8.1.7 试验数据统计与分析
8.2 结果与分析
8.2.1 MyoG启动子片段的克隆
8.2.2 MyoG启动子片段的生物信息学分析
8.2.3 MyoG启动子不同缺失片段pGL3-MyoGpro载体的构建
8.2.4 DEC1过表达载体pcDNA3.1-DEC1载体的构建
8.2.5 MyoG启动子不同缺失片段的活性检测
8.2.6 DEC1过表达抑制MyoG启动子活性
8.3 讨论
8.4 小结
第九章 过表达DEC1抑制脂肪细胞分化并下调PPARg基因的表达
9.1 材料与方法
9.1.1 试验材料与试剂
9.1.2 DEC1过表达腺病毒感染牛前体脂肪细胞
9.1.3 牛前体脂肪细胞诱导分化与油红O染色及分光光度计测定
9.1.4 荧光定量PCR检测
9.1.5 DEC1过表达时pGL3-PPARgPro启动子转录活性的测定
9.1.6 试验数据统计与分析
9.2 结果与分析
9.2.1 牛DEC1过表达抑制脂肪细胞分化
9.2.2 DEC1过表达对PPARg,FABP4,HSL和Perilipin基因mRNA表达的影响
9.2.3 DEC1过表达抑制PPARg启动子活性
9.3 讨论
9.4 小结
第十章 牛DEC1基因多态性及其与生长性状的关联分析
10.1 材料与方法
10.1.1 试验动物
10.1.2 血液基因组DNA的提取
10.1.3 PCR反应所用引物设计
10.1.4 PCR反应体系及扩增程序
10.1.5 引入酶切引物的设计
10.1.6 PCR产物酶切
10.1.7 琼脂糖凝胶电泳分析酶切产物的带型判定
10.1.8 试验数据统计与分析
10.2 结果与分析
10.2.1 DEC1基因突变位点扫描与酶切分析
10.2.2 DEC1基因突变位点遗传多态性指标
10.2.3 DEC1基因突变位点与生长性状的关联分析
10.3 讨论
10.4 小结
结论与创新点
结论
创新点
参考文献
附录
附录Ⅰ 本研究中所使用的主要试剂和仪器
附录Ⅱ 本研究中所使用的主要试验方法
致谢
作者简介
【参考文献】：
期刊论文
[1]牛MyoG基因启动子的克隆及功能的初步分析[J]. 王秋华,曹允考,李树峰,佟慧丽,兴孝友,李光鹏,严云勤. 畜牧兽医学报. 2012(01)
[2]牛肌源性干细胞的培养和鉴定[J]. 韩颖,孔庆然,尹智,魏延昌,张鑫淼,汪亦男,刘忠华. 东北农业大学学报. 2008(12)
硕士论文
[1]猪骨骼肌卫星细胞的分离培养及TRIM55基因的染色体定位、SNP检测和表达谱分析[D]. 张定校.华中农业大学 2006
本文编号：3655179
【文章页数】：115 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
文献综述
第一章 肌肉卫星细胞起源及其调控机制
1.1 肌肉卫星细胞的特性与来源
1.2 影响肌肉卫星细胞分化的转录调控
1.2.1 盒转录因子3
1.2.2 盒转录因子7
1.2.3 Myf5和MyoD
1.2.4 MyoG和MRF4
1.3 影响肌肉卫星细胞分化的其它因素
1.3.1 Notch通路
1.3.2 MiRNAs
1.3.3 低氧环境应激(Hypoxia)
1.3.4 细胞之间的互作
第二章 脂肪细胞的起源及其调控机制
2.1 脂肪的起源与形成过程
2.1.1 脂肪的起源
2.1.2 脂肪细胞分化过程
2.2 脂肪细胞分化的重要转录调控因子
2.2.1 PPARg
2.2.2 KLFs
2.2.3 SREBPs
2.2.4 C/EBP
第三章 DEC1的分子特性及对肌肉发育和脂肪沉积的调控
3.1 bHLH蛋白的分类
3.2 DEC1的分子特性与生理功能
3.2.1 DEC1基因的分子特性
3.2.2 DEC1与DEC2
3.2.3 DEC1基因的结构与生理功能
3.3 DEC1参与肌肉再生和肌肉发育调控
3.4 DEC1调控脂肪细胞分化
实验研究
第四章 牛骨骼肌卫星细胞的分离培养及鉴定
4.1 材料与方法
4.1.1 试验动物
4.1.2 试验试剂和材料
4.1.3 牛骨骼肌卫星细胞的分离
4.1.4 牛骨骼肌卫星细胞的培养与传代
4.1.5 牛骨骼肌卫星细胞的免疫荧光鉴定
4.2 结果与分析
4.2.1 牛骨骼肌卫星细胞最佳消化分离方法
4.2.2 牛骨骼肌卫星细胞的诱导分化
4.2.3 牛骨骼肌卫星细胞的细胞免疫荧光鉴定
4.3 讨论
4.4 小结
第五章 牛DEC1基因在不同组织及肌卫星细胞分化过程中表达模式分析
5.1 材料与方法
5.1.1 试验动物与组织样品的采取
5.1.2 试验试剂和材料
5.1.3 牛骨骼肌细胞的分离培养及诱导分化
5.1.4 组织和细胞RNA的提取和反转录cDNA的合成
5.1.5 荧光定量PCR检测
5.1.6 试验数据统计与分析
5.2 结果与分析
5.2.1 DEC1在牛不同发育阶段各组织的表达差异
5.2.2 DEC1在牛肌卫星细胞分化过程中的表达模式分析
5.3 讨论
5.4 小结
第六章 COCl_2诱导DEC1表达同时抑制牛肌卫星细胞分化
6.1 材料与方法
6.1.1 试验试剂
6.1.2 牛骨骼肌卫星细胞的分离培养及诱导分化
6.1.3 细胞总RNA的提取和反转录cDNA的合成
6.1.4 荧光定量PCR检测
6.1.5 Western-blot检测
6.1.6 细胞免疫荧光染色检测
6.1.7 试验数据统计与分析
6.2 结果与分析
6.2.1 在牛肌卫星细胞生长培养基中添加COCl_2对相关基因mRNA表达的调控
6.2.2 在牛肌卫星细胞诱导分化过程中添加COCl_2对相关基因mRNA表达的调控
6.2.3 Western blot检测在牛肌卫星细胞诱导分化过程中添加CoCl_2对MyoG基因蛋白水平表达的调控
6.2.4 细胞免疫荧光检测在牛肌卫星细胞诱导分化过程中添加CoCl_2对MyoG基因蛋白水平表达的调控
6.3 讨论
6.4 小结
第七章 牛DEC1基因的克隆及对肌卫星细胞分化的调控
7.1 材料与方法
7.1.1 试验材料与试剂
7.1.2 牛DEC1基因CDS区的克隆
7.1.3 牛DEC1过表达载体构建与腺病毒包装
7.1.4 DEC1重组腺病毒感染牛肌卫星细胞
7.1.5 实时定量PCR检测
7.1.6 Western blot检测
7.1.7 细胞免疫荧光检测
7.1.8 试验数据统计与分析
7.2 结果与分析
7.2.1 牛DEC1基因的克隆与序列分析
7.2.2 穿梭载体pAdTrack-CMV-DEC1和骨架载体pAd-Easy-DEC1的构建
7.2.3 DEC1过表达腺病毒的包装与扩繁
7.2.4 DEC1过表达腺病毒的鉴定
7.2.5 在普通生长培养基状态下DEC1过表达腺病毒感染牛肌卫星细胞相关基因的mRNA表达量
7.2.6 在诱导分化状态下DEC1过表达腺病毒感染牛肌卫星细胞后细胞形态差异
7.2.7 Western blot检测在诱导分化状态下DEC1过表达腺病毒感染牛肌卫星细胞后MyoG的表达
7.2.8 细胞免疫荧光检测在诱导分化状态下DEC1过表达腺病毒感染牛卫星细胞后MyoG的表达
7.3 讨论
7.4 小结
第八章 牛MyoG基因启动子活性分析及DEC1对MyoG启动子活性的调控
8.1 材料与方法
8.1.1 试验材料与试剂
8.1.2 MyoG启动子片段的克隆
8.1.3 MyoG启动子不同缺失片段pGL3-MyoGpro载体的构建
8.1.4 DEC1过表达载体pcDNA3.1-DEC1载体的构建
8.1.5 MyoG启动子不同缺失片段转录活性的测定
8.1.6 DEC1过表达时MyoG启动子转录活性的测定
8.1.7 试验数据统计与分析
8.2 结果与分析
8.2.1 MyoG启动子片段的克隆
8.2.2 MyoG启动子片段的生物信息学分析
8.2.3 MyoG启动子不同缺失片段pGL3-MyoGpro载体的构建
8.2.4 DEC1过表达载体pcDNA3.1-DEC1载体的构建
8.2.5 MyoG启动子不同缺失片段的活性检测
8.2.6 DEC1过表达抑制MyoG启动子活性
8.3 讨论
8.4 小结
第九章 过表达DEC1抑制脂肪细胞分化并下调PPARg基因的表达
9.1 材料与方法
9.1.1 试验材料与试剂
9.1.2 DEC1过表达腺病毒感染牛前体脂肪细胞
9.1.3 牛前体脂肪细胞诱导分化与油红O染色及分光光度计测定
9.1.4 荧光定量PCR检测
9.1.5 DEC1过表达时pGL3-PPARgPro启动子转录活性的测定
9.1.6 试验数据统计与分析
9.2 结果与分析
9.2.1 牛DEC1过表达抑制脂肪细胞分化
9.2.2 DEC1过表达对PPARg,FABP4,HSL和Perilipin基因mRNA表达的影响
9.2.3 DEC1过表达抑制PPARg启动子活性
9.3 讨论
9.4 小结
第十章 牛DEC1基因多态性及其与生长性状的关联分析
10.1 材料与方法
10.1.1 试验动物
10.1.2 血液基因组DNA的提取
10.1.3 PCR反应所用引物设计
10.1.4 PCR反应体系及扩增程序
10.1.5 引入酶切引物的设计
10.1.6 PCR产物酶切
10.1.7 琼脂糖凝胶电泳分析酶切产物的带型判定
10.1.8 试验数据统计与分析
10.2 结果与分析
10.2.1 DEC1基因突变位点扫描与酶切分析
10.2.2 DEC1基因突变位点遗传多态性指标
10.2.3 DEC1基因突变位点与生长性状的关联分析
10.3 讨论
10.4 小结
结论与创新点
结论
创新点
参考文献
附录
附录Ⅰ 本研究中所使用的主要试剂和仪器
附录Ⅱ 本研究中所使用的主要试验方法
致谢
作者简介
【参考文献】：
期刊论文
[1]牛MyoG基因启动子的克隆及功能的初步分析[J]. 王秋华,曹允考,李树峰,佟慧丽,兴孝友,李光鹏,严云勤. 畜牧兽医学报. 2012(01)
[2]牛肌源性干细胞的培养和鉴定[J]. 韩颖,孔庆然,尹智,魏延昌,张鑫淼,汪亦男,刘忠华. 东北农业大学学报. 2008(12)
硕士论文
[1]猪骨骼肌卫星细胞的分离培养及TRIM55基因的染色体定位、SNP检测和表达谱分析[D]. 张定校.华中农业大学 2006
本文编号：3655179
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