苜蓿中华根瘤菌CCNWSX0020抗铜相关基因研究
发布时间：2022-07-03 20:16
根瘤菌是能与豆科植物共生固氮的重要农业微生物，若长期生长于重金属污染的土壤中，根瘤菌细胞会对重金属离子产生相应的抗性。本实验室从陕西凤县金属尾矿生长的天蓝苜蓿中分离到的S. meliloti CCNWSX0020在TY培养基中能够抵抗1.4mM的Cu2+。通过在含有0.5mM的Cu2+和不含Cu2+的TY液体培养中培养菌体，利用cDNA-AFLP技术分析了两种培养条件下的差异基因表达，最终获得了3条DNA差异片段（转录衍生片段TDF）。通过比对发现TDF1所在基因编码的蛋白与S. meliloti1021的铜离子外排P-typeATPase相似性达到97%；TDF2所在基因编码的蛋白与CandidatusAccumulibacter phosphatis clade IIA str. UW-1的RNase H同源性达到42%；TDF3是omp基因的一部分，omp基因含1446个碱基，编码含481个氨基酸的假定蛋白质，它和Rhizobium leguminosarum bv. viciae3841的外膜蛋白有75%的相似性...
【文章页数】：117 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 文献综述
1.1 铜离子的危害
1.2 铜污染的来源
1.3 重金属污染的修复
1.3.1 物理化学修复
1.3.2 植物修复
1.3.3 植物-微生物联合修复
1.3.4 根瘤菌-豆科植物联合修复
1.4 微生物的抗铜机制
1.4.1 cop 系统
1.4.2 Cus 系统
1.4.3 Cue 系统
1.4.4 Pco 系统
1.4.5 抗铜基因调节系统
1.5 cDNA-AFLP 技术
1.5.1 cDNA-AFLP 原理
1.5.2 cDNA-AFLP 流程及优点
1.6 研究内容及技术路线
1.6.1 研究内容
1.6.2 技术路线
第二章 铜诱导下 CCNWSX0020 差异基因分析
2.1 前言
2.2 材料与方法
2.2.1 材料
2.2.2 实验方法
2.3 结果
2.3.1 细菌总 RNA 的提取
2.3.2 总 RNA 质量检测
2.3.3 cDNA 第一链检测
2.3.4 cDNA 双链合成
2.3.5 选择性扩增
2.3.6 PAGE 凝胶电泳
2.3.7 差异条带回收测序及分析
2.3.8 不同重金属离子胁迫下 omp 上下游基因表达分析
2.3.9 MerR-like 调控基因的检测
2.3.10 P-type ATPase 序列分析
2.4 讨论
第三章 omp 基因敲除及功能互补
3.1 引言
3.2 材料与方法
3.2.1 实验材料
3.2.2 实验方法
3.3 结果与分析
3.3.1 PK18mobsacB 正确性验证
3.3.2 omp 及卡那霉素基因插入 pGEM-T easy
3.3.3 omp 基因插入失活
3.3.4 omp 基因敲除载体构建及突变体筛选
3.3.5 突变体对 Cu~(2+)的最大抗性
3.3.6 突变体对其它金属离子的抗性变化
3.3.7 突变体互补实验
3.4 讨论
第四章 铜诱导下菌体抗氧化酶及代谢物分析
4.1 引言
4.2 材料与方法
4.2.1 实验材料
4.2.2 实验方法
4.3 实验结果
4.3.1 突变体 IAA 含量的测定
4.3.2 CCNWSX0020 抗氧化酶的测定
4.3.3 CCNWSX0020 代谢物的测定
4.4 讨论
第五章 S. meliloti CCNWSX0020 全基因测序
5.1 引言
5.2 材料与方法
5.2.1 实验材料
5.2.2 实验方法
5.3 实验结果
5.3.1 基因组特性
5.3.2 重金属抗性
5.3.3 CCNWSX0020 中促进植物生长的基因
5.3.4 抗氧化系统
5.4 讨论
第六章 结论与展望
6.1 结论
6.1.1 S. meliloti CCNWSX0020 细胞 RNA 提取方法建立
6.1.2 铜诱导下差异 DNA 片段分析
6.1.3 omp 基因敲除
6.1.4 功能互补实验
6.1.5 野生型与突变体代谢物分析
6.1.6 全基因组测序及分析验证
6.2 创新点
6.3 展望
参考文献
附录一
附录二
致谢
作者简介
博士期间发表的论文及科研情况
本文编号：3655576
【文章页数】：117 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 文献综述
1.1 铜离子的危害
1.2 铜污染的来源
1.3 重金属污染的修复
1.3.1 物理化学修复
1.3.2 植物修复
1.3.3 植物-微生物联合修复
1.3.4 根瘤菌-豆科植物联合修复
1.4 微生物的抗铜机制
1.4.1 cop 系统
1.4.2 Cus 系统
1.4.3 Cue 系统
1.4.4 Pco 系统
1.4.5 抗铜基因调节系统
1.5 cDNA-AFLP 技术
1.5.1 cDNA-AFLP 原理
1.5.2 cDNA-AFLP 流程及优点
1.6 研究内容及技术路线
1.6.1 研究内容
1.6.2 技术路线
第二章 铜诱导下 CCNWSX0020 差异基因分析
2.1 前言
2.2 材料与方法
2.2.1 材料
2.2.2 实验方法
2.3 结果
2.3.1 细菌总 RNA 的提取
2.3.2 总 RNA 质量检测
2.3.3 cDNA 第一链检测
2.3.4 cDNA 双链合成
2.3.5 选择性扩增
2.3.6 PAGE 凝胶电泳
2.3.7 差异条带回收测序及分析
2.3.8 不同重金属离子胁迫下 omp 上下游基因表达分析
2.3.9 MerR-like 调控基因的检测
2.3.10 P-type ATPase 序列分析
2.4 讨论
第三章 omp 基因敲除及功能互补
3.1 引言
3.2 材料与方法
3.2.1 实验材料
3.2.2 实验方法
3.3 结果与分析
3.3.1 PK18mobsacB 正确性验证
3.3.2 omp 及卡那霉素基因插入 pGEM-T easy
3.3.3 omp 基因插入失活
3.3.4 omp 基因敲除载体构建及突变体筛选
3.3.5 突变体对 Cu~(2+)的最大抗性
3.3.6 突变体对其它金属离子的抗性变化
3.3.7 突变体互补实验
3.4 讨论
第四章 铜诱导下菌体抗氧化酶及代谢物分析
4.1 引言
4.2 材料与方法
4.2.1 实验材料
4.2.2 实验方法
4.3 实验结果
4.3.1 突变体 IAA 含量的测定
4.3.2 CCNWSX0020 抗氧化酶的测定
4.3.3 CCNWSX0020 代谢物的测定
4.4 讨论
第五章 S. meliloti CCNWSX0020 全基因测序
5.1 引言
5.2 材料与方法
5.2.1 实验材料
5.2.2 实验方法
5.3 实验结果
5.3.1 基因组特性
5.3.2 重金属抗性
5.3.3 CCNWSX0020 中促进植物生长的基因
5.3.4 抗氧化系统
5.4 讨论
第六章 结论与展望
6.1 结论
6.1.1 S. meliloti CCNWSX0020 细胞 RNA 提取方法建立
6.1.2 铜诱导下差异 DNA 片段分析
6.1.3 omp 基因敲除
6.1.4 功能互补实验
6.1.5 野生型与突变体代谢物分析
6.1.6 全基因组测序及分析验证
6.2 创新点
6.3 展望
参考文献
附录一
附录二
致谢
作者简介
博士期间发表的论文及科研情况
本文编号：3655576
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