猪肺炎支原体P97全基因重组腺病毒的构建及其免疫原性

发布时间：2022-07-07 14:46

　　由猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp）引起的猪支原体肺炎（Mycoplasmal pneumonia of swine,MPS）是一种广泛存在于我国猪场并严重影响我国生猪养殖业健康发展的病原体。Mhp因其特殊的细胞结构而没有特效治疗药物,对常规的药物又极易产生耐药性,猪场一旦发生MPS就很难控制,因此做好免疫防控成了减少MPS损失的唯一有效途径。Mhp的培养条件苛刻,且培养物滴度较低,这直接影响了Mhp常规疫苗的研制与应用。所以,开发出一种成本低廉,效果确实的Mhp疫苗成了养猪业迫切的需求。本研究运用重组腺病毒载体表达技术,将Mhp的主要抗原基因粘附因子P97全基因重组到腺病毒穿梭载体,用脂质体介导的转染方法将重组穿梭载体pacAd5 Shuttle-P97与骨架质粒转入包装细胞AD293中,构建出了重组腺病毒Ad-P97,并对其免疫效果进行了检测与评价,得到了以下试验结果:（1）利用KM₂培养基培养Mhp,离心收集菌体并提取其基因组DNA。以基因组DNA为模板,采用分段PCR的方式分别扩增了P97的前后两段基因,再利用酶切、连... 

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摘要
Abstract
中英文缩略词对照
1 文献综述
    1.1 猪肺炎支原体的研究概况
        1.1.1 病原学
        1.1.2 流行病学
        1.1.3 发病机制
        1.1.4 临床症状及病理变化
    1.2 猪肺炎支原体基因组结构及主要抗原蛋白
        1.2.1 猪肺炎支原体基因组结构
        1.2.2粘附因子P97与P102
        1.2.3膜蛋白P46和P65
        1.2.4 热休克蛋白Dnak
        1.2.5细胞质蛋白P36
    1.3 国内外猪肺炎支原体疫苗研究进展
        1.3.1 MPS常规疫苗
        1.3.2 MPS基因工程疫苗
    1.4 腺病毒载体的研究进展
        1.4.1 重组腺病毒载体的构建策略
        1.4.2 腺病毒载体的大量扩增与纯化
        1.4.3 腺病毒载体的安全性
    1.5 研究的目的与意义
        1.5.1 研究目的
        1.5.2 研究意义
2 猪肺炎支原体粘附因子P97全基因的克隆
    2.1 试验材料
        2.1.1 试验用猪肺炎支原体菌株
        2.1.2 主要试剂
        2.1.3 相关溶液系统配制方法
        2.1.4 主要仪器设备
    2.2 试验方法
        2.2.1 Mhp标准株的复苏与扩大培养
        2.2.2 Mhp基因组基因的提取
        2.2.3 PCR引物设计与合成
        2.2.4 P97全基因的PCR扩增
    2.3 结果
        2.3.1 Mhp基因组DNA提取浓度测定结果
        2.3.2 分段PCR结果
        2.3.3 目的基因P97前与P97后的酶切结果
        2.3.4 连接及P97全基因扩增结果
    2.4 讨论
3 穿梭载体pacAd5 Shuttle-P97的构建与P97基因序列分析
    3.1 材料
        3.1.1 主要试剂
        3.1.2 相关培养基配制
    3.2 试验方法
        3.2.1 感受态细胞的制备
        3.2.2 腺病毒表达载体质粒的扩增与纯化
        3.2.3 重组穿梭质粒pacAd5 Shuttle-P97的构建
        3.2.4 重组穿梭质粒pacAd5 Shuttle-P97的测序与序列分析
    3.3 结果
        3.3.1 腺病毒表达载体质粒的扩增纯化结果
        3.3.2 穿梭质粒与P97基因双酶切结果
        3.3.3 重组穿梭质粒pacAd5 Shuttle-P97的构建
        3.3.4 重组穿梭质粒pacAd5 Shuttle-P97的测序结果
    3.4 讨论
4 P97基因的定点突变
    4.1 材料与方法
        4.1.1 材料
        4.1.2 方法
    4.2 结果
        4.2.1 重叠延伸PCR结果
        4.2.2 重组穿梭质粒pacAd5 Shuttle-TB-P97的测序结果与比对
    4.3 讨论
5 重组腺病毒pacAd5-P97的构建
    5.1 材料
        5.1.1 试验材料
        5.1.2 细胞培养及转染相关试剂
        5.1.3 RNA提取与反转录相关试剂
        5.1.4 免疫印迹相关试剂
        5.1.5 免疫荧光相关试剂
        5.1.6 主要仪器
        5.1.7 主要溶液系统配制
    5.2 方法
        5.2.1 腺病毒载体表达系统相关质粒的PacⅠ酶切
        5.2.2 包装细胞AD293细胞的复苏与培养
        5.2.3 转染
        5.2.4 重组腺病毒Ad-P97的反转录PCR(RT-PCR)鉴定
        5.2.5 免疫印迹(Western-blot)检测P97蛋白的表达
        5.2.6 重组腺病毒Ad-P97和Ad-GFP在PK15细胞中的表达
        5.2.7 重组腺病毒Ad-P97以及Ad-GFP的大量扩增及滴度测定
    5.3 结果
        5.3.1 腺病毒载体表达系统质粒的PacⅠ单酶切
        5.3.2 重组腺病毒Ad-P97与Ad-GFP的构建
        5.3.3 重组腺病毒的鉴定结果
        5.3.4 重组腺病毒的滴度测定结果
    5.4 讨论
6 重组腺病毒疫苗Ad-P97的免疫效果初步评价
    6.1 材料
        6.1.1 试验材料
        6.1.2 试验动物及分组
        6.1.3 主要试剂及耗材
        6.1.4 主要仪器
        6.1.5 相关溶液系统配制
    6.2 方法
        6.2.1 Ad-P97的小鼠免疫及其免疫效果评价
        6.2.2 Ad-P97抗血清对Mhp黏附宿主细胞的阻断作用
        6.2.3 Ad-P97对仔猪免疫效果测定
    6.3 结果
        6.3.1 小鼠淋巴细胞转化试验结果
        6.3.2 免疫小鼠血清中P97抗体水平
        6.3.3 Ad-P97抗血清对Mhp黏附PK15细胞的阻断作用
        6.3.4 玻片凝集试验检测仔猪血清抗体水平
    6.4 讨论
7 结论
参考文献
附录
致谢
作者简介
导师简介


【参考文献】：
期刊论文
[1]猪肺炎支原体致病机理研究进展[J]. 李彦伟,刘茂军,武昱孜,张旭,李桂兰,张映,邵国青.  动物医学进展. 2013(08)
[2]猪肺炎支原体主要抗原蛋白的研究进展[J]. 张悦,刘茂军,邵国青.  中国农学通报. 2013(02)
[3]猪肺炎支原体黏附宿主细胞间接免疫荧光检测方法的建立[J]. 车巧林,熊祺琰,冯志新,张旭,刘茂军,邵国青.  江苏农业学报. 2012(05)
[4]猪气喘病的诊断与防制措施[J]. 李凤仙,熊梅,唐春华.  科技信息. 2012(25)
[5]猪肺炎支原体地方毒株P97-R1基因序列分析及原核表达[J]. 贾丽艳,高玉花,张映.  中国农学通报. 2012(20)
[6]PCR技术检测猪肺炎支原体的研究进展[J]. 张旭,白方方,武昱孜,刘茂军,冯志新,熊祺琰,张映,邵国青.  生物技术通报. 2012(05)
[7]猪肺炎支原体P46基因的原核表达与间接ELISA方法的建立[J]. 沈青春,王芳,韩明远,覃青松,范学政,杨汉春,宁宜宝.  畜牧兽医学报. 2012(03)
[8]猪肺炎支原体的分离方法[J]. 韦艳娜,白昀,孔猛,冯志新,刘茂军,熊祺琰,白方方,吴叙苏,邵国青.  江苏农业学报. 2012(01)
[9]重组人p53腺病毒注射液（今又生）临床研究进展[J]. 关大刚,郑旭.  现代肿瘤医学. 2011(12)
[10]腺病毒载体用于基因治疗的研究进展[J]. 胡奇婵,陈玥,王丽,杨举伦.  解放军医药杂志. 2011(05)

硕士论文
[1]猪肺炎支原体P97蛋白单克隆抗体的制备[D]. 王亮.中国农业科学院 2008



本文编号：3656615