鼠肝炎病毒N蛋白多抗制备和ELISA方法的建立与应用

发布时间：2022-07-12 18:03

　　鼠肝炎病毒（Mouse hepatitis virus, MHV）属于冠状病毒科冠状病毒属（Coronavirus）,是一种单股正链RNA病毒,在实验动物中带毒小鼠存在非常广泛,在各实验室中均有发现。而其中不同类型、不同毒株病毒在不同年龄、品系和免疫状态的小鼠中均可发现,并且可引起肝炎、脑脊髓炎和肠炎等许多不同症状。在很多情况下,我们可以发现带毒小鼠呈隐性感染的占有很大比重,然而在鼠肝炎病毒与某些微生物发生混合感染时,或是在某些条件的刺激下我们会发现有疾病的爆发,鼠肝炎病毒是啮齿类实验动物感染的各种病毒中最难清除的病毒之一。感染鼠肝炎病毒的鼠群,其各种免疫应答参数会发生改变,对十实验结果产生各种影响,因此本实验开展了该病间接ELISA快速诊断方法的研究。本文首先根据GenBank中公布的MHV-A59N基因序列（AY700211）,加入酶切位点与保护性碱基设计了一对特异性引物,然后通过RT-PCR扩增出N基因的主要抗原片段NS片段,将目的片段纯化后与pMD18-T载体连接得到重组质粒pMD18-T-N,双酶切胶回收目的基因片段克隆到原核表达载体pET-32a中,构建了重组质粒pET-3... 

【文章页数】：49 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
1 前言
    1.1 鼠肝炎病毒研究进展
    1.2 鼠肝炎病毒的结构特征
    1.3 鼠肝炎病毒的分子特征
    1.4 鼠肝炎病毒理化特征
    1.5 鼠肝炎流行病学
    1.6 临床症状及病理变化
    1.7 鼠肝炎病毒对实验的影响
    1.8 诊断方法的研究
    1.9 预防和控制
    1.10 研究目的和意义
2 材料与方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 病毒株、细胞株、菌株
        2.1.2 实验动物
        2.1.3 主要工具酶、抗体及分子生物学试剂盒
        2.1.4 主要药品及试剂
        2.1.5 主要实验仪器设备
    2.2 试验方法
        2.2.1 MHV-A59 N基因的获得及原核表达质粒pET-32a-N的构建
        2.2.2 重组蛋白的表达
        2.2.3 MHV N蛋白多克隆抗体的制备
        2.2.4 MHV间接ELISA检测方法的建立
        2.2.5 MHV间接ELISA检测方法的初步应用
3 实验结果
    3.1 MHV-N蛋白多克隆抗体制备
        3.1.1 原核表达质粒pET-32a-N的构建
        3.1.2 MHGN蛋白的原核表达
        3.1.3 原核表达蛋白的纯化
        3.1.4 多抗血清检测
    3.2 间接ELISA检测方法的建立
        3.2.1 抗原最适浓度
        3.2.2 血清最适浓度
        3.2.3 血清最适作用时间
        3.2.4 酶标抗体最佳作用浓度
        3.2.5 酶标抗体最佳作用时间
        3.2.6 封闭液的选择
        3.2.7 敏感性结果
        3.2.8 稳定性试验结果
        3.2.9 与间接免疫荧光比较
    3.3 间接ELISA检测方法的应用
4 讨论
    4.1 表达蛋白基因的选择
    4.2 连接转化条件的选择
    4.3 原核表达载体的选择
    4.4 诱导表达条件的优化
    4.5 蛋白的纯化
    4.6 ELISA检测方法条件的摸索
5 结论
致谢
参考文献
攻读硕士学位期间发表的学术论文



本文编号：3659598