鸭坦布苏病毒反向遗传操作系统的建立
发布时间：2022-07-12 18:07
鸭坦布苏病毒病是由鸭坦布苏病毒引起的一种新发病毒病，病鸭主要表现为高热、食欲下降、产蛋下降，严重可导致死亡，给我国养鸭业造成了巨大的损失。本研究利用前期分离鉴定得到的一株强毒株FX2010株，建立了该毒株的反向遗传操作系统，为研究该病毒分子致病机制奠定基础。为建立FX2010株的反向遗传操作系统，首先提取病毒的RNA，利用RT-PCR方法，分片段扩增了病毒的全基因组，相邻片段的末端序列相互重叠。病毒基因组4020位之前的片段通过融合PCR的方式扩增得到，作为全长基因的前半段；根据病毒基因组中单一酶切位点的位置，将病毒基因组的3656位至10991位的序列克隆至pSIMPLE18平端载体上，从而得到覆盖鸭坦布苏病毒后半段基因组的质粒3-N-pSIMPLE。在5’端引入T7启动子，用ApaLI酶切3-N-pSIMPLE得到后半段，利用融合PCR的方法得到该病毒的全长PCR产物。然后利用体外转录的方法制备具有感染性的病毒体外转录本，纯化后转染至DF-1细胞并注意观察细胞变化，与对照相比，发现转染病毒RNA的细胞在转染48h后开始出现病变，72h出现明显病变。经过RT-PCR，间接免疫荧光（I...
【文章页数】：62 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
符号与缩略语 中文摘要 Abstract 1 前言
1.1 鸭坦布苏病毒概述
1.2 分子生物学特性
1.2.1 形态结构
1.2.2 在细胞内的复制
1.2.3 培养特性
1.3 鸭坦布苏病毒的研究进展
1.4 反向遗传操作系统概述
1.4.1 RNA 病毒的反向遗传技术
1.4.2 黄病毒的反向遗传操作系统的研究进展
1.4.3 黄病毒反向遗传操作系统的应用
1.5 研究的目的及意义 2 材料与方法
2.1 材料
2.1.1 病毒和细胞
2.1.2 主要试剂
2.2 方法
2.2.1 FX2010 株感染性 DNA 的构建
2.2.1.1 病毒核酸提取
2.2.1.2 反转录
2.2.1.3 全长序列的分片段引物设计及克隆策略
2.2.1.4 全长分片段 PCR 扩增
2.2.1.5 克隆构建
2.2.1.6 FX2010 株全长 DNA 的获取
2.2.2 FX2010 株病毒的拯救
2.2.2.1 体外转录
2.2.2.2 体外转录产物纯化
2.2.2.3 转染
2.2.2.4 拯救病毒的鉴定
2.2.3 基因重配病毒的拯救
2.2.3.1 基因重配病毒基因组构建策略
2.2.3.2 基因重配病毒全长 DNA 的获得 3 结果与分析
3.1 FX2010 株分片段扩增结果
3.2 FX2010 株融合全长两半端电泳结果
3.3 FX2010 株全长 DNA 电泳图
3.4 FX2010 株病毒拯救结果
3.4.1 细胞病变
3.4.2 RT-PCR 鉴定结果
3.4.3 间接免疫荧光试验结果
3.4.4 鸡胚致病性试验结果
3.4.5 序列比对结果
3.5 基因重配病毒的拯救结果
3.5.1 电泳结果
3.5.2 细胞病变
3.5.3 测序比对结果 4 讨论
4.1 反向遗传操作系统
4.2 基因重配病毒研究 5 结论 参考文献 附录 致谢 攻读学位期间发表论文情况
【参考文献】：
期刊论文
[1]新型黄病毒在种鹅中垂直传播的研究[J]. 赵冬敏,黄欣梅,刘宇卓,张敬峰,李银. 南方农业学报. 2012(01)
[2]鸭坦布苏病毒病病原的分离鉴定及生物学特性研究[J]. 李泽君. 中国家禽. 2011(17)
[3]鸭坦布苏病毒抗体间接ELISA检测方法的建立[J]. 姬希文,闫丽萍,颜丕熙,李国新,张七斤,李泽君. 中国预防兽医学报. 2011(08)
[4]我国发现的一种引起鸭产蛋下降综合征的新型黄病毒[J]. 胡旭东,路浩,刘培培,遇秀玲,李爽,王勇月,莫毅诚,张国中,田克恭,高福,苏敬良. 中国兽医杂志. 2011(07)
[5]鸭出血性卵巢炎的研究进展[J]. 张大丙. 中国家禽. 2011(14)
[6]一种从鸭新分离的黄病毒研究初报[J]. 李玉峰,马秀丽,于可响,王友令,高巍,黄兵,徐怀英,吴静,王生雨,王莉莉,秦卓明. 畜牧兽医学报. 2011(06)
[7]鸡黄病毒的分离与初步鉴定[J]. 傅光华,黄瑜,施少华,万春和,程龙飞,陈红梅,林芳,林建生. 福建畜牧兽医. 2011(03)
[8]应用套式RT-PCR快速检测鸭坦布苏病毒[J]. 颜丕熙,李国新,吴晓刚,闫丽萍,滕巧泱,李泽君. 中国动物传染病学报. 2011(03)
[9]一种引起蛋鸡产蛋下降的新型黄病毒的分离与初步鉴定[J]. 陈仕龙,陈少莺,王劭,林锋强,江斌,程晓霞,黄梅清,朱小丽,李兆龙. 福建农业学报. 2011(02)
[10]鸭传染性产蛋减少症(暂定名)的病原分离初报[J]. 廖敏,牟小东,耿阳,边葶苈,陆新浩,陈秋英,任祖伊,丁铲,周继勇. 中国动物传染病学报. 2011(01)
硕士论文
[1]鸭坦布苏病毒分离鉴定及其生物学特性的研究[D]. 颜丕熙.中国农业科学院 2012
本文编号：3659604
【文章页数】：62 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
符号与缩略语 中文摘要 Abstract 1 前言
1.1 鸭坦布苏病毒概述
1.2 分子生物学特性
1.2.1 形态结构
1.2.2 在细胞内的复制
1.2.3 培养特性
1.3 鸭坦布苏病毒的研究进展
1.4 反向遗传操作系统概述
1.4.1 RNA 病毒的反向遗传技术
1.4.2 黄病毒的反向遗传操作系统的研究进展
1.4.3 黄病毒反向遗传操作系统的应用
1.5 研究的目的及意义 2 材料与方法
2.1 材料
2.1.1 病毒和细胞
2.1.2 主要试剂
2.2 方法
2.2.1 FX2010 株感染性 DNA 的构建
2.2.1.1 病毒核酸提取
2.2.1.2 反转录
2.2.1.3 全长序列的分片段引物设计及克隆策略
2.2.1.4 全长分片段 PCR 扩增
2.2.1.5 克隆构建
2.2.1.6 FX2010 株全长 DNA 的获取
2.2.2 FX2010 株病毒的拯救
2.2.2.1 体外转录
2.2.2.2 体外转录产物纯化
2.2.2.3 转染
2.2.2.4 拯救病毒的鉴定
2.2.3 基因重配病毒的拯救
2.2.3.1 基因重配病毒基因组构建策略
2.2.3.2 基因重配病毒全长 DNA 的获得 3 结果与分析
3.1 FX2010 株分片段扩增结果
3.2 FX2010 株融合全长两半端电泳结果
3.3 FX2010 株全长 DNA 电泳图
3.4 FX2010 株病毒拯救结果
3.4.1 细胞病变
3.4.2 RT-PCR 鉴定结果
3.4.3 间接免疫荧光试验结果
3.4.4 鸡胚致病性试验结果
3.4.5 序列比对结果
3.5 基因重配病毒的拯救结果
3.5.1 电泳结果
3.5.2 细胞病变
3.5.3 测序比对结果 4 讨论
4.1 反向遗传操作系统
4.2 基因重配病毒研究 5 结论 参考文献 附录 致谢 攻读学位期间发表论文情况
【参考文献】：
期刊论文
[1]新型黄病毒在种鹅中垂直传播的研究[J]. 赵冬敏,黄欣梅,刘宇卓,张敬峰,李银. 南方农业学报. 2012(01)
[2]鸭坦布苏病毒病病原的分离鉴定及生物学特性研究[J]. 李泽君. 中国家禽. 2011(17)
[3]鸭坦布苏病毒抗体间接ELISA检测方法的建立[J]. 姬希文,闫丽萍,颜丕熙,李国新,张七斤,李泽君. 中国预防兽医学报. 2011(08)
[4]我国发现的一种引起鸭产蛋下降综合征的新型黄病毒[J]. 胡旭东,路浩,刘培培,遇秀玲,李爽,王勇月,莫毅诚,张国中,田克恭,高福,苏敬良. 中国兽医杂志. 2011(07)
[5]鸭出血性卵巢炎的研究进展[J]. 张大丙. 中国家禽. 2011(14)
[6]一种从鸭新分离的黄病毒研究初报[J]. 李玉峰,马秀丽,于可响,王友令,高巍,黄兵,徐怀英,吴静,王生雨,王莉莉,秦卓明. 畜牧兽医学报. 2011(06)
[7]鸡黄病毒的分离与初步鉴定[J]. 傅光华,黄瑜,施少华,万春和,程龙飞,陈红梅,林芳,林建生. 福建畜牧兽医. 2011(03)
[8]应用套式RT-PCR快速检测鸭坦布苏病毒[J]. 颜丕熙,李国新,吴晓刚,闫丽萍,滕巧泱,李泽君. 中国动物传染病学报. 2011(03)
[9]一种引起蛋鸡产蛋下降的新型黄病毒的分离与初步鉴定[J]. 陈仕龙,陈少莺,王劭,林锋强,江斌,程晓霞,黄梅清,朱小丽,李兆龙. 福建农业学报. 2011(02)
[10]鸭传染性产蛋减少症(暂定名)的病原分离初报[J]. 廖敏,牟小东,耿阳,边葶苈,陆新浩,陈秋英,任祖伊,丁铲,周继勇. 中国动物传染病学报. 2011(01)
硕士论文
[1]鸭坦布苏病毒分离鉴定及其生物学特性的研究[D]. 颜丕熙.中国农业科学院 2012
本文编号：3659604
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