弓形虫ROP18和SAG1乳酸杆菌活载体疫苗株的构建及其免疫效果评价

发布时间：2017-05-14 19:11

  本文关键词：弓形虫ROP18和SAG1乳酸杆菌活载体疫苗株的构建及其免疫效果评价，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：弓形虫病(Toxoplasmosis)是一种全球分布的人兽共患寄生虫病,其病原为刚地弓形虫(Toxoplasma gondii),严重危害人畜健康。该病的流行,不但给畜牧业带来巨大的经济损失,也带来严重的公共卫生问题。弓形虫是细胞内寄生原虫,目前还没有治疗弓形虫病的特效药物,因此尽快研制安全有效的弓形虫疫苗对防止该病的传播有重要意义。乳酸菌以其独特的益生作用常作为活载体的首选菌。本研究首次将弓形虫基因ROP18和SAG1连接到pSIP409载体上,构建重组表达质粒pSIP409-ROP18和pSIP409-SAG1,检测其在乳酸杆菌Nc8中的表达情况,最终将表达弓形虫ROP18和SAG1重组乳酸杆菌免疫小白鼠,然后检测其诱导的黏膜免疫的保护效果。具体研究方法和结果如下:1.弓形虫基因ROP18和SAG1原核表达载体的构建及重组乳酸杆菌的制备从弓形虫RH株中扩增出ROP18和SAG1基因,与大肠杆菌-乳酸杆菌穿梭表达载体pSIP409进行连接,并将重组质粒转化入乳酸杆菌Nc8中,通过重组质粒酶切和PCR鉴定筛选出阳性菌落,然后对阳性菌进行SppIP诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和Western blot检测,结果表明,在67kDa和39kDa处有阳性条带。2.重组乳酸杆菌免疫小白鼠以及免疫效果的检测将小白鼠分为5组(pSIP409-ROP18-Nc8,pSIP409-SAG1-Nc8,pSIP409-Nc8,乳和空白对照组),免疫期间采集小白鼠血清样品、肺脏、和小肠的冲洗液进行ELISA检测,检测血清IgG的含量,检测肺脏和小肠冲洗液中sIgA的含量,用流式细胞仪检测脾淋巴细胞中CD4+、CD8+的表达水平。结果显示,两组重组乳酸杆菌免疫组抗体水平高于其他三组,CD4+、CD8+淋巴细胞含量增多,脾淋巴细胞在抗原刺激后增殖,但差异不显著。以上结果表明,重组质粒pSIP409-ROP18和pSIP409-SAG1在乳酸杆菌Nc8中获得了表达,并且免疫动物后增强了动物的免疫功能,但表达量较少,需进一步优化反应条件。本次试验首次成功构建了弓形虫乳酸杆菌活载体疫苗pSIP409-ROP18-Nc8和pSIP409-SAG1-Nc8,并成功在乳酸杆菌Nc8中表达,表达产物具有一定的免疫原性,但是表达量较少。用该疫苗免疫小白鼠后,对小白鼠产生了一定的保护力,但是免疫效果不是很好,需要更进一步的研究,该研究为预防弓形虫病的活载体疫苗的研究奠定了基础。
【关键词】：弓形虫病 活载体疫苗 ROP18 SAG1 乳酸杆菌 黏膜免疫
【学位授予单位】：甘肃农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.4
【目录】：

• 摘要3-4
• Summary4-8
• 主要缩略词英汉对照表8-10
• 第一章 引言10-15
• 1.1 弓形虫病10
• 1.2 黏膜免疫系统概述10
• 1.3 活载体疫苗10-11
• 1.3.1 乳酸菌和乳酸杆菌的益生作用11
• 1.3.2 乳酸杆菌活载体疫苗的优点11
• 1.4 弓形虫病疫苗的研究进展11-14
• 1.4.1 灭活疫苗12
• 1.4.2 弱毒疫苗12
• 1.4.3 DNA疫苗12-13
• 1.4.4 基因缺失疫苗13
• 1.4.5 亚单位疫苗13
• 1.4.6 活载体疫苗13-14
• 1.5 总结与展望14-15
• 第二章 弓形虫重组表达质粒的构建15-27
• 2.1 材料与方法15-24
• 2.1.1 材料15-18
• 2.1.1.1 工具酶和主要试剂15
• 2.1.1.2 主要仪器设备15-16
• 2.1.1.3 主要试剂16
• 2.1.1.4 试剂配制16-17
• 2.1.1.5 引物17-18
• 2.1.2 方法18-24
• 2.1.2.1 DNA的提取18
• 2.1.2.2 PCR扩增ROP18和SAG1基因的PCR扩增体系18-19
• 2.1.2.3 ROP18和SAG1基因PCR扩增产物的琼脂糖电泳分析19
• 2.1.2.4 ROP18和SAG1基因PCR扩增产物的凝胶回收和纯化19-20
• 2.1.2.5 ROP18和SAG1基因PCR扩增产物的连接20
• 2.1.2.6 重组质粒ROP18/T、SAG1/T的转化20-21
• 2.1.2.7 提取重组质粒T-ROP18、T-SAG121
• 2.1.2.8 感受态细胞（JM109）的制备21
• 2.1.2.9 重组质粒T-ROP18、T-SAG1在感受态细胞（JM109）中的转化21-22
• 2.1.2.10 菌液PCR鉴定22
• 2.1.2.11 提取表达载体质粒p SIP40922
• 2.1.2.12 ROP18、SAG1基因和p SIP409表达载体双酶切片段的回收22
• 2.1.2.13 重组质粒p SIP409-ROP18和p SIP409-SAG1的构建22-23
• 2.1.2.14 目的基因ROP18、SAG1与p SIP409质粒的连接23-24
• 2.1.2.15 重组质粒p SIP409-ROP18、p SIP409-SAG1的转化24
• 2.1.2.16 重组质粒p SIP409-ROP18、p SIP409-SAG1的PCR鉴定24
• 2.1.2.17 重组质粒p SIP409-ROP18、p SIP409-SAG1的提取24
• 2.1.2.18 重组质粒p SIP409-ROP18、p SIP409-SAG1的双酶切鉴定24
• 2.2 结果24-25
• 2.2.1 目的基因的鉴定结果24-25
• 2.3 讨论25-27
• 第三章 弓形虫重组表达质粒在乳酸杆菌Nc8中的表达27-35
• 3.1 材料与方法27-32
• 3.1.1 材料27-30
• 3.1.1.1 菌种27
• 3.1.1.2 主要仪器设备27
• 3.1.1.3 试剂的配置27-30
• 3.1.2 方法30-32
• 3.1.2.1 乳酸菌Nc8感受态的制备30
• 3.1.2.2 乳酸菌的电转化30-31
• 3.1.2.3 乳酸菌质粒的提取31
• 3.1.2.4 重组乳酸菌的诱导表达及SDS-PAGE分析31-32
• 3.1.2.5 重组乳酸菌Western blot分析32
• 3.2 结果32-34
• 3.2.1 重组乳酸杆菌菌液PCR鉴定32-33
• 3.2.2 重组乳酸杆菌的SDS-PAGE结果鉴定33
• 3.2.3 重组乳酸杆菌的Western blot结果鉴定33-34
• 3.3 讨论34-35
• 3.3.1 电转化方法的确定34
• 3.3.2 重组乳酸杆菌表达蛋白的条件优化34
• 3.3.3 重组乳酸杆菌的SDS-PAGE和Western blot结果分析34-35
• 第四章 重组乳酸杆菌对小白鼠黏膜免疫的效果研究35-47
• 4.1 材料与方法35-39
• 4.1.1 材料35-36
• 4.1.1.1 试验动物35
• 4.1.1.2 主要仪器及设备35
• 4.1.1.3 主要试剂及配制方法35-36
• 4.1.2 方法36-39
• 4.1.2.1 试验动物分组及免疫36
• 4.1.2.2 小鼠血清的制备36
• 4.1.2.3 小鼠肺脏和小肠浸出液的制备36
• 4.1.2.4 血清中Ig G抗体及Ig G1、Ig G2a抗体亚类的检测36-37
• 4.1.2.5 试验小鼠脾淋巴细胞悬液的制备37-38
• 4.1.2.6 试验小鼠脾淋巴细胞增殖试验（MTT法）38
• 4.1.2.7 细胞因子IFN-γ、IL2、IL4和IL10的检测38
• 4.1.2.8 脾脏CD3+CD4+CD8-和CD3+CD8+CD4-细胞的检测38-39
• 4.1.2.9 肺脏和小肠中s Ig A的检测39
• 4.1.2.10 免疫保护力试验-----腹腔注射感染弓形虫RH珠39
• 4.2 结果39-45
• 4.2.1 试验鼠血清中抗体Ig G和抗体亚类Ig G1、Ig G2a的分布情况39-41
• 4.2.1.1 免疫期间试验鼠血清中Ig G的分布情况39-40
• 4.2.1.2 试验鼠血清中Ig G1、Ig G2a的分布情况40-41
• 4.2.2 脾淋巴细胞增殖试验的结果41
• 4.2.3 细胞因子IFN-γ、IL2、IL4、IL10的检测41-43
• 4.2.3.1 细胞因子标准曲线的绘制41-42
• 4.2.3.2 各细胞因子检测结果42-43
• 4.2.3.2.1 IFN-γ检测结果42
• 4.2.3.2.2 IL2检测结果42
• 4.2.3.2.3 IL4检测结果42
• 4.2.3.2.4 IL10检测结果42-43
• 4.2.4 流式细胞分选仪分析CD3+CD4+CD8-和CD3+CD8+CD4-细胞43-44
• 4.2.5 肺脏和小肠中s Ig A的检测结果44-45
• 4.2.6 试验鼠腹腔注射弓形虫RH株的效果评价45
• 4.3 讨论45-47
• 第五章 全文结论47-48
• 参考文献48-54
• 致谢54-55
• 作者简历55-56
• 导师简介56-58

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1 倪晓婷;弓形虫ROP18和SAG1乳酸杆菌活载体疫苗株的构建及其免疫效果评价[D];甘肃农业大学;2016年

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本文编号：366019