牛多杀性巴氏杆菌菌影疫苗的制备及其免疫效力分析

发布时间：2017-05-14 19:17

  本文关键词：牛多杀性巴氏杆菌菌影疫苗的制备及其免疫效力分析，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：牛巴氏杆菌病又称为牛出血性败血症,是由多杀性巴氏杆菌感染引起的一种急性传染病,急性型呈出血性败血症迅速死亡;慢性病例的病变多限于局部器官,通常表现为皮下结缔组织、关节、脏器的化脓性病灶。目前用于预防牛多杀性巴氏杆菌病的疫苗主要为强毒株的灭活菌苗,弱毒活菌疫苗和亚单位疫苗,由于传统的细菌全菌体灭活疫苗的免疫效果不理想,不能提供较强的保护力,弱毒活菌疫苗由于其本身存在活的多杀性巴氏杆菌,在宿主动物机体中存在毒力返强的风险。因此研制一种安全有效的疫苗对控制牛巴氏杆菌病具有重要意义。本试验以pHH43质粒为模板,通过PCR扩增含噬菌体PhiX174的裂解基因E和CI857-PL-PR启动阻遏系统组成的温敏裂解盒CI857-PL-PR-E,再将裂解盒插入到pPBA1100载体中,构建裂解质粒pPBA1100-E。利用电转化的方法将其转入牛多杀性巴氏杆菌中,将含有裂解质粒的牛多杀性巴氏杆菌在37℃条件下培养至OD600nm值约为0.4时,将培养温度升至42℃进行诱导,制备牛多杀性巴氏杆菌菌影,分别计算诱导前细菌数和诱导后细菌数计算裂解效率,其裂解效率可达99.997%。经电镜观察发现裂解后的细菌保留了细菌的基本形态结构,内容物几乎全部释放到菌体外,仅留下细菌空壳,在菌体中间可见明显的孔洞。应用制备的菌影疫苗对小鼠进行免疫接种,分析菌影疫苗对小鼠的免疫效力。将100只5周龄的雌性BALB/c小白鼠,随机分成4组:菌影组、菌影+佐剂组、灭活苗组和PBS对照组,每组25只,实验室适应1周后,间隔两周连续接种两次。在免疫前采血分离血清做阴性血清,在一免2周后,二免2周后采血分离血清利用间接ELISA方法检测小鼠血清中IgG抗体的水平,同时使用细胞因子检测试剂盒检测二免两周后各组小鼠血清中IL-4、和IFN-γ的含量;然后从二免后3周开始连续数周采集血液,每次间隔一周,检测小鼠血清中IgG抗体的消长趋势。每次免疫两周后每组处死5只小白鼠,无菌取出脾脏,从脾脏中分离淋巴细胞,检测免疫后CD4+和CD8+T淋巴细胞的动态变化。在二免2周后用牛多杀性巴氏杆菌对小鼠进行攻毒,攻毒后记录小鼠的存活率。从体液以及细胞免疫水平对牛多杀性巴氏杆菌菌影疫苗的免疫效力进行分析。试验结果显示,本试验制备的牛多杀性巴氏杆菌菌影疫苗可诱导小鼠产生较高水平的体液免疫和细胞免疫,可为小鼠抵抗牛多杀性巴氏杆菌的攻击提供较高的保护力。本试验为进一步研究牛多杀性巴氏杆菌菌影疫苗奠定了基础。
【关键词】：牛多杀性巴氏杆菌 裂解质粒 菌影疫苗 保护效力
【学位授予单位】：黑龙江八一农垦大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.4
【目录】：

• 摘要4-6
• abstract6-12
• 第一章 文献综述12-26
• 1.1 多杀性巴氏杆菌的研究概况12-23
• 1.1.1 多杀性巴氏杆菌的流行与危害12
• 1.1.2 多杀性巴氏杆菌的生物学特性12-13
• 1.1.3 多杀性巴氏杆菌的分型13-16
• 1.1.4 牛巴氏杆菌病的临床症状和病理变化16-17
• 1.1.5 多杀性巴氏杆菌的诊断方法17-19
• 1.1.6 多杀性巴氏杆菌主要的毒力因子19-21
• 1.1.7 多杀性巴氏杆菌疫苗研究进展21-23
• 1.2 菌影疫苗23-24
• 1.2.1 菌影疫苗的研究进展23-24
• 1.2.2 菌影疫苗的形成机制24
• 1.2.3 菌影疫苗的优势24
• 1.3 本研究的目的与意义24-26
• 第二章 材料与方法26-38
• 2.1 材料26-27
• 2.1.1 菌种、质粒及试验动物26
• 2.1.2 主要实验仪器设备26
• 2.1.3 主要药品及试剂26-27
• 2.2 方法27-38
• 2.2.1 裂解质粒p PBA1100-E的构建27-31
• 2.2.2 牛多杀性巴氏杆菌菌影的制备31-33
• 2.2.3 免疫动物及攻毒试验33-34
• 2.2.4 小鼠血清中特异性抗体的检测34-35
• 2.2.5 CD4+和CD8+ T淋巴细胞的检测35-36
• 2.2.6 血清中细胞因子的检测36-37
• 2.2.7 数据处理37-38
• 第三章 试验结果38-50
• 3.1 裂解质粒p PBA1100-E的构建38-40
• 3.1.1 裂解盒CI857-PL-PR-E的扩增38
• 3.1.2 裂解质粒p PBA1100-E的PCR和双酶切鉴定38-40
• 3.2 细菌裂解率影响因素的筛选40
• 3.3 裂解质粒的裂解水平检测40-41
• 3.4 裂解效率计算结果41
• 3.5 重组质粒p PBA1100-E的稳定性试验结果41-43
• 3.6 菌影的扫描电镜观察结果43
• 3.7 无菌检验43
• 3.8 LD50的测定结果43-44
• 3.9 攻毒保护性试验结果44
• 3.10 攻毒后脏器荷菌数的检测结果44
• 3.11 小鼠血清中特异性抗体的检测结果44-47
• 3.12 小鼠脾脏淋巴细胞中CD4+和CD8+ T细胞的动态变化47-48
• 3.12.1 脾脏中CD4+T细胞亚群占总淋巴细胞百分比的动态变化47
• 3.12.2 脾脏中CD8+ T细胞亚群占总淋巴细胞百分比的动态变化47-48
• 3.13 血清中细胞因子的检测48-50
• 3.13.1 血清中 IL-4 含量的测定结果48
• 3.13.2 血清中IL-4 含量的测定48-50
• 第四章 讨论50-54
• 4.1 裂解质粒p PBA1100-E的溶菌情况50
• 4.2 诱导起始菌液浓度对细菌裂解率的影响50-51
• 4.3 牛多杀性巴氏杆菌菌影刺激小鼠机体产生抗体的水平51
• 4.4 小鼠脾脏淋巴细胞中CD4+和CD8+T细胞亚群的动态变化51-52
• 4.5 小鼠血清中细胞因子含量的检测52
• 4.6 牛多杀性巴氏杆菌菌影对小鼠的保护作用52-54
• 第五章 结论54-56
• 附录56-58
• 参考文献58-64
• 致谢64-66
• 个人简历66

【参考文献】

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本文编号：366042