卵黄高磷蛋白对鸡胚胎骨骼发育的影响
发布时间：2022-07-19 10:51
鸡蛋中的卵黄高磷蛋白（phosvitin）是已知所有蛋白质中磷酸化程度最高的蛋白质,含磷量占蛋黄总磷量的80%,是鸡胚骨骼发育中矿物质磷的主要来源。本文以phosvitin作为研究对象,围绕着phosvitin对鸡胚胎骨骼发育的影响开展了系列工作。主要研究内容和研究成果摘要如下：研究了鸡胚胎发育期间与骨骼发育相关指标的变化规律。发现鸡胚胎发育9-10d是一个转折点：蛋清pH在9d胚龄以后,逐渐趋于稳定,保持在pH7.5左右；蛋黄pH在10d胚龄时突然上升,达到最大值8.19,之后呈小幅度下降,在pH7.5附近相对稳定；蛋黄总磷含量在10d胚龄时出现急剧下降,这与胚胎在9d胚龄开始骨化有很大相关性。比较分析蛋黄磷含量的降低速率、碱性磷酸酶活力变化以及鸡胚体长的增长发现三者的变化趋势基本一致,先上升后下降。在14-16d总磷下降速率最快,平均达到0.027mg/g.d, ALP活力也达到最大值1.12U/gprot,体长增长率的变化有一定滞后,在17d胚龄增长率达到最大,1.17cm/d,这与蛋黄中的磷被转移到胚胎然后被胚胎骨骼发育利用需要一定时间有关。研究了胚胎发育的9-20d phos...
【文章页数】：95 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
缩略语表
第一章 文献综述
1 生物矿化的概述
2 生物矿化与蛋白调控
3 磷蛋白对生物矿化的影响
3.1 骨桥蛋白与生物矿化
3.2 骨唾液酸蛋白与生物矿化
3.3 牙本质磷蛋白与生物矿化
3.4 牙本质基质蛋白与生物矿化
4 Phosvitin与生物矿化
4.1 Phosvitin的组成和结构
4.2 Phosvitin与生物矿化
5 细胞培养技术在生物矿化中的应用
5.1 成骨细胞
5.2 体外成骨细胞分离培养的应用
5.3 骨形成有关的生化指标
5.3.1 碱性磷酸酶(ALP)
5.3.2 骨钙蛋白(OCN)
5.3.3 骨形态发生蛋白-2(BMP-2)
5.3.4 核心结合因子(Runx-2)
5.3.5 Ⅰ型胶原(Col-Ⅰ)
6 实时定量RT-PCR技术在生物矿化研究中的应用
7 本课题选题的学术思想
7.1 研究目的和意义
7.2 学术思路
7.3 主要研究内容
第二章 鸡胚胎发育期间与骨骼发育相关指标的测定
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 原料
1.1.2 主要试剂
1.1.3 主要仪器和设备
1.2 方法
1.2.1 实验设计
1.2.2 蛋黄样品的采集
1.2.3 蛋清蛋黄pH测定
1.2.4 蛋黄中钙磷含量的测定
1.2.5 胚胎胫骨中ALP活性的测定
1.2.6 胚胎体长及胫骨长度测定
1.2.7 数据处理
2 结果与分析
2.1 孵化期间蛋清、蛋黄pH值的变化
2.2 孵化期间蛋黄中总钙、总磷含量的变化
2.3 孵化期间鸡胚胫骨中碱性磷酸酶(ALP)活力的变化
2.4 孵化期间鸡胚胫骨长度及鸡胚体长的变化
2.5 相关性分析
3 讨论
4 小结
第三章 鸡胚胎发育过程中phosvitin的变化
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 原料
1.1.2 主要试剂
1.1.3 主要仪器和设备
1.2 方法
1.2.1 实验设计
1.2.2 蛋黄样品的采集
1.2.3 phosvitin的分离与纯化
1.2.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)
1.2.5 Phosvitin中有机磷含量的测定
1.2.6 Phosvitin中有机氮含量的测定
1.2.7 磷蛋比(P/N radio)的计算
1.2.8 红外光谱测定
1.2.9 圆二色谱测定
1.2.10 数据处理
2 结果与分析
2.1 孵化期间phosvitin分子量测定
2.2 孵化期间phosvitin磷氮比的变化
2.3 孵化期间phosvitin红外吸收图谱分析
2.4 孵化期间phosvitin二级结构的变化
2.4.1 红外光谱分析法
2.4.2 圆二色谱分析法
3 讨论
4 小结
第四章 Phosvitin对MC3T3-E1细胞生长的影响
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 原料
1.1.2 主要试剂
1.1.3 主要仪器和设备
1.2 方法
1.2.1 实验设计
1.2.2 Phosvitin提取纯化
1.2.3 细胞培养操作程序
1.2.4 CCK-8法测定细胞增殖
1.2.5 流式细胞仪测定细胞周期
1.2.6 MC3T3-E1细胞凋亡率的检测(流式法)
1.2.7 数据处理
2 结果与分析
2.1 Phosvitin纯度鉴定
2.2 MC3T3-E1细胞生长曲线的测定
2.3 Phosvitin对MC3T3-E1细胞活力的影响
2.4 Phosvitin对MC3T3-E1细胞周期的影响
2.5 Phosvitin对MC3T3-E1细胞凋亡的影响
3 讨论
4 小结
第五章 Phosvitin对MC3T3-E1细胞矿化的影响
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 原料
1.1.2 主要试剂
1.1.3 主要仪器和设备
1.2 方法
1.2.1 实验设计
1.2.2 Phosvitin提取纯化
1.2.3 细胞培养操作程序
1.2.4 成骨细胞中ALP活性测定
1.2.5 矿化结节茜素红染色
1.2.6 MC3T3-E1细胞总RNA提取与RT-PCR反应
1.2.7 数据处理
2 结果与分析
2.1 诱导矿化实验的接种密度的确立
2.2 茜素红染色结果
2.3 碱性磷酸酶(ALP)活力测定结果
2.4 MC3T3-E1诱导矿化相关基因mRNA表达量的测定
2.4.1 不同矿化诱导剂对Runx-2 mRNA表达量的影响
2.4.2 不同矿化诱导剂对BMP-2 mRNA表达量的影响
2.4.3 不同矿化诱导剂对Col-Ⅰ mRNA表达量的影响
2.4.4 不同矿化诱导剂对OCN mRNA表达量的影响
3 讨论
4 小结
第六章 结论和展望
1 结论
2 创新性
3 延续研究计划
参考文献
附录
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]益骨胶囊含药血清对共育体系中成骨细胞表达骨保护素mRNA的影响[J]. 徐立群,张荣华,傅淑平,杨丽. 中华生物医学工程杂志. 2012 (02)
[2]AA3型连续流动分析仪测定土壤和植物全氮的方法研究[J]. 张英利,许安民,尚浩博,马爱生. 西北农林科技大学学报(自然科学版). 2006(10)
[3]骨代谢标志物研究进展[J]. 陶庆树,周振雷,胡丹,侯加法. 畜牧与兽医. 2006(02)
[4]鸡类胰岛素生长因子Ⅰ的克隆、表达及其表达产物的生物学活性研究[J]. 张建峰,侯加法,张皎,姚静. 中国农业科学. 2005(10)
[5]山羊成骨细胞的体外培养和鉴定[J]. 钟代彬,吴培福,曲伟杰,王梅,苏敬良,金久善,韩博. 中国兽医科技. 2005(05)
[6]体外培养大鼠成骨细胞实验模型的建立[J]. 刘莉,常红,黄国伟,王媛,白绍蓓. 天津医科大学学报. 2004(01)
[7]成骨细胞分化产物及其生化标志研究进展[J]. 徐青,田秀巧,张会丰. 临床荟萃. 2003(01)
[8]条件培养液对兔骨髓基质细胞向成骨细胞分化的影响[J]. 武和明,邢树忠,张晓旻. 医学研究生学报. 2002(01)
[9]降钙素对体外培养成骨细胞的影响[J]. 朱建民,方浩,陈新刚,曾明,金蔚芳,王洪复. 中国骨质疏松杂志. 2001(02)
[10]水溶性BSA-羟基磷灰石-碳酸钙复合物的形成机理[J]. 沈玉华,杨展澜,谢安键,吴瑾光. 光谱学与光谱分析. 2000(06)
博士论文
[1]蛋白调控骨、牙矿化的研究及模拟[D]. 程振江.清华大学 2010
本文编号：3663280
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【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
缩略语表
第一章 文献综述
1 生物矿化的概述
2 生物矿化与蛋白调控
3 磷蛋白对生物矿化的影响
3.1 骨桥蛋白与生物矿化
3.2 骨唾液酸蛋白与生物矿化
3.3 牙本质磷蛋白与生物矿化
3.4 牙本质基质蛋白与生物矿化
4 Phosvitin与生物矿化
4.1 Phosvitin的组成和结构
4.2 Phosvitin与生物矿化
5 细胞培养技术在生物矿化中的应用
5.1 成骨细胞
5.2 体外成骨细胞分离培养的应用
5.3 骨形成有关的生化指标
5.3.1 碱性磷酸酶(ALP)
5.3.2 骨钙蛋白(OCN)
5.3.3 骨形态发生蛋白-2(BMP-2)
5.3.4 核心结合因子(Runx-2)
5.3.5 Ⅰ型胶原(Col-Ⅰ)
6 实时定量RT-PCR技术在生物矿化研究中的应用
7 本课题选题的学术思想
7.1 研究目的和意义
7.2 学术思路
7.3 主要研究内容
第二章 鸡胚胎发育期间与骨骼发育相关指标的测定
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 原料
1.1.2 主要试剂
1.1.3 主要仪器和设备
1.2 方法
1.2.1 实验设计
1.2.2 蛋黄样品的采集
1.2.3 蛋清蛋黄pH测定
1.2.4 蛋黄中钙磷含量的测定
1.2.5 胚胎胫骨中ALP活性的测定
1.2.6 胚胎体长及胫骨长度测定
1.2.7 数据处理
2 结果与分析
2.1 孵化期间蛋清、蛋黄pH值的变化
2.2 孵化期间蛋黄中总钙、总磷含量的变化
2.3 孵化期间鸡胚胫骨中碱性磷酸酶(ALP)活力的变化
2.4 孵化期间鸡胚胫骨长度及鸡胚体长的变化
2.5 相关性分析
3 讨论
4 小结
第三章 鸡胚胎发育过程中phosvitin的变化
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 原料
1.1.2 主要试剂
1.1.3 主要仪器和设备
1.2 方法
1.2.1 实验设计
1.2.2 蛋黄样品的采集
1.2.3 phosvitin的分离与纯化
1.2.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)
1.2.5 Phosvitin中有机磷含量的测定
1.2.6 Phosvitin中有机氮含量的测定
1.2.7 磷蛋比(P/N radio)的计算
1.2.8 红外光谱测定
1.2.9 圆二色谱测定
1.2.10 数据处理
2 结果与分析
2.1 孵化期间phosvitin分子量测定
2.2 孵化期间phosvitin磷氮比的变化
2.3 孵化期间phosvitin红外吸收图谱分析
2.4 孵化期间phosvitin二级结构的变化
2.4.1 红外光谱分析法
2.4.2 圆二色谱分析法
3 讨论
4 小结
第四章 Phosvitin对MC3T3-E1细胞生长的影响
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 原料
1.1.2 主要试剂
1.1.3 主要仪器和设备
1.2 方法
1.2.1 实验设计
1.2.2 Phosvitin提取纯化
1.2.3 细胞培养操作程序
1.2.4 CCK-8法测定细胞增殖
1.2.5 流式细胞仪测定细胞周期
1.2.6 MC3T3-E1细胞凋亡率的检测(流式法)
1.2.7 数据处理
2 结果与分析
2.1 Phosvitin纯度鉴定
2.2 MC3T3-E1细胞生长曲线的测定
2.3 Phosvitin对MC3T3-E1细胞活力的影响
2.4 Phosvitin对MC3T3-E1细胞周期的影响
2.5 Phosvitin对MC3T3-E1细胞凋亡的影响
3 讨论
4 小结
第五章 Phosvitin对MC3T3-E1细胞矿化的影响
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 原料
1.1.2 主要试剂
1.1.3 主要仪器和设备
1.2 方法
1.2.1 实验设计
1.2.2 Phosvitin提取纯化
1.2.3 细胞培养操作程序
1.2.4 成骨细胞中ALP活性测定
1.2.5 矿化结节茜素红染色
1.2.6 MC3T3-E1细胞总RNA提取与RT-PCR反应
1.2.7 数据处理
2 结果与分析
2.1 诱导矿化实验的接种密度的确立
2.2 茜素红染色结果
2.3 碱性磷酸酶(ALP)活力测定结果
2.4 MC3T3-E1诱导矿化相关基因mRNA表达量的测定
2.4.1 不同矿化诱导剂对Runx-2 mRNA表达量的影响
2.4.2 不同矿化诱导剂对BMP-2 mRNA表达量的影响
2.4.3 不同矿化诱导剂对Col-Ⅰ mRNA表达量的影响
2.4.4 不同矿化诱导剂对OCN mRNA表达量的影响
3 讨论
4 小结
第六章 结论和展望
1 结论
2 创新性
3 延续研究计划
参考文献
附录
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]益骨胶囊含药血清对共育体系中成骨细胞表达骨保护素mRNA的影响[J]. 徐立群,张荣华,傅淑平,杨丽. 中华生物医学工程杂志. 2012 (02)
[2]AA3型连续流动分析仪测定土壤和植物全氮的方法研究[J]. 张英利,许安民,尚浩博,马爱生. 西北农林科技大学学报(自然科学版). 2006(10)
[3]骨代谢标志物研究进展[J]. 陶庆树,周振雷,胡丹,侯加法. 畜牧与兽医. 2006(02)
[4]鸡类胰岛素生长因子Ⅰ的克隆、表达及其表达产物的生物学活性研究[J]. 张建峰,侯加法,张皎,姚静. 中国农业科学. 2005(10)
[5]山羊成骨细胞的体外培养和鉴定[J]. 钟代彬,吴培福,曲伟杰,王梅,苏敬良,金久善,韩博. 中国兽医科技. 2005(05)
[6]体外培养大鼠成骨细胞实验模型的建立[J]. 刘莉,常红,黄国伟,王媛,白绍蓓. 天津医科大学学报. 2004(01)
[7]成骨细胞分化产物及其生化标志研究进展[J]. 徐青,田秀巧,张会丰. 临床荟萃. 2003(01)
[8]条件培养液对兔骨髓基质细胞向成骨细胞分化的影响[J]. 武和明,邢树忠,张晓旻. 医学研究生学报. 2002(01)
[9]降钙素对体外培养成骨细胞的影响[J]. 朱建民,方浩,陈新刚,曾明,金蔚芳,王洪复. 中国骨质疏松杂志. 2001(02)
[10]水溶性BSA-羟基磷灰石-碳酸钙复合物的形成机理[J]. 沈玉华,杨展澜,谢安键,吴瑾光. 光谱学与光谱分析. 2000(06)
博士论文
[1]蛋白调控骨、牙矿化的研究及模拟[D]. 程振江.清华大学 2010
本文编号：3663280
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