牛源犬新孢子虫AMA1基因核酸疫苗与重组腺病毒疫苗的制备及动物免疫

发布时间：2022-08-09 15:31

　　新孢子虫病是由犬新孢子虫引起牛和其它动物的重要的原虫病,该病可引起牛的流产、死胎及神经系统障碍疾病,已给养牛业造成了严重的经济损失。对新孢子虫病的防控目前尚无有效的方法。目前,以病毒为载体的疫苗得到了广泛研究,其中腺病毒载体疫苗在寄生虫领域也得到了应用且卓见成效,而以DNA疫苗初免、病毒载体疫苗加强免疫的策略在诱导接种动物体液免疫和细胞免疫方面显示了良好的效果。本试验根据GenBank中（AB265823.1）已公布的犬新孢子虫AMA1基因序列,设计并合成扩增AMA1基因的两对特异性引物,应用RT-PCR方法对牛源犬新孢子虫吉林株AMA1基因进行扩增,将扩增的AMA1基因克隆至pMD18-T simple载体,将测序正确的AMA1基因分别亚克隆至pVAX-1真核表达载体与pCR259腺病毒穿梭载体。将构建的pVAX1-AMA1真核表达质粒转入Vero细胞进行表达,并通过间接免疫荧光和western blot检测其表达产物,之后通过质粒中提试剂盒大提pVAX1-AMA1质粒,制备核酸疫苗。同时将构建的重组腺病毒穿梭质粒pCR259-NcAMAl依次转化HighQ-1Transpose-A... 

【文章页数】：62 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
前言
    1 概述
        1.1 新孢子虫
        1.2 新孢子虫的生活史
        1.3 新孢子虫病
    2 免疫学研究
    3 新孢子虫病的防治
    4 新孢子虫抗原
    5 腺病毒载体
    6 Prime-Boost免疫策略
    7 研究目的与意义
材料与方法
    1 材料
        1.1 虫株与细胞株
        1.2 载体与实验动物
        1.3 血清、培养液及二抗
        1.4 主要试剂
        1.5 主要仪器设备
        1.6 试验所需主要溶液
    2 方法
        2.1 引物的设计与合成
        2.2 细胞和虫体培养
        2.3 感受态细胞的制备
        2.4 虫体总RNA的提取
        2.5 犬新孢子虫AMA1基因的扩增
        2.6 PCR产物的纯化
        2.7 犬新孢子虫AMA1基因的克隆
        2.8 重组pVAX1-AMA1质粒的构建
        2.9 重组质粒pVAX1-AMA1的大量提取
        2.10 重组质粒pVAX1-AMA1的表达
        2.11 重组腺病毒穿梭质粒pCR259-AMA1的构建
        2.12 AMA1基因重组腺病毒表达载体的构建
        2.13 AMA1基因重组腺病毒表达质粒的线性化
        2.14 AMA1基因重组腺病毒的包装
        2.15 重组腺病毒Ad5-NcAMA1的鉴定
        2.16 重组腺病毒Ad5-NcAMA1 TCID_(50)的测定
        2.17 动物免疫试验
        2.18 小鼠血清中抗体水平的检测
        2.19 小鼠血清中IgG1、IgG2a水平检测
        2.20 小鼠血清中IFN-γ、IL-4水平检测
        2.21 CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群测定
        2.22 数据分析
结果
    1 AMA1基因的扩增
    2 重组质粒pMD18-AMA1的鉴定
    3 重组表达质粒pVAX1-AMA1的鉴定
    4 pVAX1-AMA1质粒中AMA1基因表达的鉴
        4.1 间接免疫荧光检测AMA1基因的表达
        4.2 Western blot检测AMA1基因的表达
    5 重组腺病毒穿梭质粒pCR259-AMA1的鉴定
    6 重组腺病毒表达质粒294-AMA1的鉴定
    7 AMA1基因重组腺病毒的包装
    8 重组腺病毒Ad5-NcAMA1的鉴定
        8.1 PCR检测AMA1基因
        8.2 间接免疫荧光检测AMA1基因的表达
        8.3 Western blot检测AMA1基因的表达
    9 重组腺病毒Ad5-NcAMA1病毒滴度测定
    10 BALB/c小鼠血清中的特异性抗体检测结果
        10.1 IgG检测结果
        10.2 IgG1检测结果
        10.3 IgG2a检测结果
    11 BALB/c小鼠T淋巴细胞亚群含量检测
    12 外周血中细胞因子水平检测
        12.1 IL-4检测结果
        12.2 IFN-γ检测结果
讨论
结论
参考文献
致谢
附录A (作者简介)
附录B (在研期间发表的论文)


【参考文献】：
期刊论文
[1]U937单核细胞几种不同转染方法的比较[J]. 潘俊杰,施海明,罗心平,李剑,梁旺,张进,马端.  复旦学报(医学版). 2010(05)
[2]河南地区PRRS的病原分离鉴定及血清学调查[J]. 赵坤,李敬玺,王三虎,王丽荣,王承民,李军民.  安徽农业科学. 2005(09)



本文编号：3672812