HEK293T细胞敲除TPL2基因促进塞内卡病毒复制的研究

发布时间：2022-08-23 18:41

　　肿瘤进展位点2 （TPL2）在不同病毒感染过程中扮演着不同角色。为探究TPL2对塞内卡病毒（SVA）复制的影响,本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建TPL2基因敲除HEK293T细胞系,以PCR测序和Western-blot对TPL2敲除效率进行双重鉴定,同时检测TPL2缺失对细胞形态和细胞增殖速度的影响。最后,用SVA感染细胞,采用IFA、RT-qPCR、Western-blot和TCID₅₀方法检测病毒增殖水平,综合评价TPL2敲除对SVA复制的影响。结果,获得两株敲除TPL2基因的HEK293T细胞。随机选取B1细胞株(HEK293T-TPL2^-/-)进行后续功能评价,发现TPL2敲除后细胞的增殖速度与对照HEK293T细胞无显著差异,均为贴壁、上皮样细胞形态。SVA感染后与对照细胞相比,敲除TPL2基因显著增加病毒拷贝数,病毒mRNA的转录,病毒蛋白的翻译以及子代病毒的毒力。综上所述,本研究成功建立TPL2基因敲除HEK293T细胞系并证明TPL2在SVA感染过程中发挥着抗病毒作用,为进一步揭示TPL2相关免疫反应和SVA... 

【文章页数】：10 页

【文章目录】：
1 材料与方法
    1.1 细胞、质粒与病毒
    1.2 试剂和抗体
    1.3 TPL2 oligo sgRNA引物的设计及合成
    1.4 重组质粒p X-EZ-TPL2-sgRNA的构建
    1.5 HEK293T细胞培养与转染
    1.6 敲除TPL2基因的单克隆细胞株筛选
    1.7 TPL2基因敲除HEK293T细胞系的鉴定
    1.8 TPL2基因敲除HEK293T细胞系的细胞形态学观察和增殖速度分析
    1.9 病毒感染
    1.1 0 Real-time Quantitative PCR(RT-qPCR)
    1.1 1 蛋白质免疫印迹试验（Western-blot)
    1.1 2 间接免疫荧光（IFA)
    1.1 3 病毒感染力测定（TCID50)
    1.1 4 统计学分析
2 结果
    2.1 重组质粒pX-EZ-TPL2-sgRNA的构建
    2.2 TPL2基因敲除HEK293T细胞系的构建及鉴定
    2.3 TPL2基因敲除HEK293T细胞系形态和增殖速度分析
    2.4 TPL2基因敲除对SVA转录的影响
    2.5 TPL2基因敲除对SVA蛋白表达的影响
    2.6 TPL2基因敲除对SVA TCID50滴度的影响
3 讨论
4 结论


【参考文献】：
期刊论文
[1]利用重组慢病毒载体共表达Cas9-sgRNA构建TLR4基因敲除DF1细胞系[J]. 庞中兵,王伟,刘赛宝,王辉,陈洪岩,孟庆文.  中国兽医科学. 2018(08)



本文编号：3678283