构建表达新城疫病毒F、HN基因重组杆状病毒及其免疫效果的研究
发布时间：2022-09-17 13:46
新城疫（Newcastle disease,ND）是一种由副粘病毒科新城疫病毒（Newcastle diseas virus,NDV）引起的禽类致死性传染病,该病具有发病急、死亡率高等特点,严重危害了我国养禽业。F蛋白是NDV的主要保护性抗原之一,可以诱导机体产生中和性抗体,并在机体免疫中发挥重要作用;而HN蛋白是NDV的另一保护性抗原,同样可以对机体起到一定的保护作用。然而在不同表达系统中,F与HN蛋白对机体的免疫保护率却不尽相同。因此,选择合适的抗原基因来对机体进行免疫显得至关重要。本研究以新城疫病毒Lasota株的F及HN为目的基因,将二者分别插入带有CMV启动子及VSV-GED、WPRE、ITRs等不同调控元件的假型化杆状病毒与未经改造的杆状病毒基因转移载体中,通过Bac-to-Bac表达系统获得重组Bacmid DNA,将其转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒;利用高滴度重组杆状病毒侵染鸡胚成纤维细胞,通过SDS-PAGE和Western blotting比较不同抗原基因在禽类细胞中的表达水平;同时利用获得的重组杆状病毒直接作为疫苗进行免疫,比较分析带有不同调控元件及不同抗原...
【文章页数】：116 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
中文摘要
ABSTRACT
符号与缩略语
第1章 绪论
1.1 新城疫病毒的研究进展
1.1.1 ND的流行
1.1.2 NDV的生物学性状
1.1.3 NDV基因组结构特征
1.1.4 NDV基因编码的主要蛋白及其功能
1.1.5 ND的防制
1.2 新城疫基因工程疫苗研究进展
1.2.1 核酸疫苗
1.2.2 亚单位疫苗
1.2.3 活载体疫苗
1.2.4 以NDV为活载体构建多价疫苗
1.3 杆状病毒表达载体系统概述
1.3.1 杆状病毒的生物学特征
1.3.2 杆状病毒表达系统及其优缺点
1.4 杆状病毒作为疫苗载体的应用
1.4.1 杆状病毒作为哺乳动物疫苗载体的应用
1.4.2 杆状病毒作为禽类疫苗载体的应用
1.4.3 杆状病毒双表达系统在疫苗载体中的应用
1.5 本研究的目的和意义
1.6 本研究的实验技术路线
1.6.1 重组杆状病毒转移载体的构建策略
1.6.2 重组杆状病毒的扩增和外源基因的表达
1.6.3 重组杆状病毒免疫效果的研究
1.7 课题资助名称
第2章 材料与方法
2.1 试验材料
2.1.1 供试材料
2.1.2 供试菌种和质粒
2.1.3 扩增引物
2.1.4 主要仪器设备
2.1.5 主要分子生物学及生化试剂
2.1.6 主要缓冲液及试剂配制
2.2 试验方法
2.2.1 重组转移载体的构建
2.2.2 重组杆状病毒穿梭载体Bacmid DNA的获得
2.2.3 重组杆状病毒穿梭载体Bacmid DNA转染Sf9昆虫细胞
2.2.4 重组杆状病毒的扩增及滴度测定
2.2.5 重组杆状病毒在鸡胚成纤维细胞中表达
2.2.6 重组蛋白的SDS-PAGE及其Western-blotting检测
2.2.7 VSV-GED蛋白的间接免疫荧光检测
2.2.8 重组杆状病毒的鸡体免疫试验
第3章 结果
3.1 重组转移载体的构建
3.1.1 重组转移载体pLM-F系列的构建
3.1.2 重组转移载体pLM-HN系列的构建
3.2 重组杆状病毒穿梭载体的鉴定
3.2.1 重组穿梭转移载体Bacmid F系列的鉴定
3.2.2 重组穿梭转移载体Bacmid HN系列的鉴定
3.3 重组杆状病毒穿梭载体转染Sf9昆虫细胞
3.3.1 Sf9昆虫细胞生长曲线的绘制
3.3.2 Sf9昆虫细胞正常及病变形态比较
3.4 重组杆状病毒的扩增及滴度测定
3.4.1 重组杆状病毒滴度测定
3.4.2 重组杆状病毒的PCR鉴定
3.5 重组杆状病毒介导目的基因在鸡胚成纤维细胞中的表达及分析
3.5.1 鸡胚成纤维细胞的形态
3.5.2 重组蛋白的SDS-PAGE及其Western-blotting鉴定
3.5.3 重组蛋白的Western blotting分析
3.6 VSV-GED蛋白的间接免疫荧光检测
3.7 动物免疫—攻毒试验
3.7.1 免疫和攻毒后各试验组的临床症状及免疫保护率
3.7.2 病理学观察
3.7.3 F48E9强毒株TCID_(50)的测定
3.7.4 免疫鸡血清中和抗体效价的测定
3.7.5 免疫鸡血清IgG抗体检测
3.7.6 免疫鸡淋巴细胞增殖试验
3.7.7 免疫鸡血清细胞因子检测
第4章 讨论
4.1 课题背景
4.2 编码的抗原基因对重组杆状病毒疫苗免疫原性的影响
4.3 载体对重组杆状病毒疫苗免疫原性的影响
4.3.1 WPRE和VSV-GED元件对外源基因表达效率的影响
4.3.2 ITRs对外源基因表达的影响
4.4 免疫剂量和免疫程序的选择
第5章 结论
参考文献
附录
致谢
攻读硕士学位期间发表学术论文情况
本文编号：3679333
【文章页数】：116 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
中文摘要
ABSTRACT
符号与缩略语
第1章 绪论
1.1 新城疫病毒的研究进展
1.1.1 ND的流行
1.1.2 NDV的生物学性状
1.1.3 NDV基因组结构特征
1.1.4 NDV基因编码的主要蛋白及其功能
1.1.5 ND的防制
1.2 新城疫基因工程疫苗研究进展
1.2.1 核酸疫苗
1.2.2 亚单位疫苗
1.2.3 活载体疫苗
1.2.4 以NDV为活载体构建多价疫苗
1.3 杆状病毒表达载体系统概述
1.3.1 杆状病毒的生物学特征
1.3.2 杆状病毒表达系统及其优缺点
1.4 杆状病毒作为疫苗载体的应用
1.4.1 杆状病毒作为哺乳动物疫苗载体的应用
1.4.2 杆状病毒作为禽类疫苗载体的应用
1.4.3 杆状病毒双表达系统在疫苗载体中的应用
1.5 本研究的目的和意义
1.6 本研究的实验技术路线
1.6.1 重组杆状病毒转移载体的构建策略
1.6.2 重组杆状病毒的扩增和外源基因的表达
1.6.3 重组杆状病毒免疫效果的研究
1.7 课题资助名称
第2章 材料与方法
2.1 试验材料
2.1.1 供试材料
2.1.2 供试菌种和质粒
2.1.3 扩增引物
2.1.4 主要仪器设备
2.1.5 主要分子生物学及生化试剂
2.1.6 主要缓冲液及试剂配制
2.2 试验方法
2.2.1 重组转移载体的构建
2.2.2 重组杆状病毒穿梭载体Bacmid DNA的获得
2.2.3 重组杆状病毒穿梭载体Bacmid DNA转染Sf9昆虫细胞
2.2.4 重组杆状病毒的扩增及滴度测定
2.2.5 重组杆状病毒在鸡胚成纤维细胞中表达
2.2.6 重组蛋白的SDS-PAGE及其Western-blotting检测
2.2.7 VSV-GED蛋白的间接免疫荧光检测
2.2.8 重组杆状病毒的鸡体免疫试验
第3章 结果
3.1 重组转移载体的构建
3.1.1 重组转移载体pLM-F系列的构建
3.1.2 重组转移载体pLM-HN系列的构建
3.2 重组杆状病毒穿梭载体的鉴定
3.2.1 重组穿梭转移载体Bacmid F系列的鉴定
3.2.2 重组穿梭转移载体Bacmid HN系列的鉴定
3.3 重组杆状病毒穿梭载体转染Sf9昆虫细胞
3.3.1 Sf9昆虫细胞生长曲线的绘制
3.3.2 Sf9昆虫细胞正常及病变形态比较
3.4 重组杆状病毒的扩增及滴度测定
3.4.1 重组杆状病毒滴度测定
3.4.2 重组杆状病毒的PCR鉴定
3.5 重组杆状病毒介导目的基因在鸡胚成纤维细胞中的表达及分析
3.5.1 鸡胚成纤维细胞的形态
3.5.2 重组蛋白的SDS-PAGE及其Western-blotting鉴定
3.5.3 重组蛋白的Western blotting分析
3.6 VSV-GED蛋白的间接免疫荧光检测
3.7 动物免疫—攻毒试验
3.7.1 免疫和攻毒后各试验组的临床症状及免疫保护率
3.7.2 病理学观察
3.7.3 F48E9强毒株TCID_(50)的测定
3.7.4 免疫鸡血清中和抗体效价的测定
3.7.5 免疫鸡血清IgG抗体检测
3.7.6 免疫鸡淋巴细胞增殖试验
3.7.7 免疫鸡血清细胞因子检测
第4章 讨论
4.1 课题背景
4.2 编码的抗原基因对重组杆状病毒疫苗免疫原性的影响
4.3 载体对重组杆状病毒疫苗免疫原性的影响
4.3.1 WPRE和VSV-GED元件对外源基因表达效率的影响
4.3.2 ITRs对外源基因表达的影响
4.4 免疫剂量和免疫程序的选择
第5章 结论
参考文献
附录
致谢
攻读硕士学位期间发表学术论文情况
本文编号：3679333
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/dongwuyixue/3679333.html
