重组猪EGF乳酸乳球菌的构建及其对早期断奶仔猪肠道健康的影响

发布时间：2022-10-04 21:44

　　早期断奶是仔猪生长过程中重大的创伤性事件,断奶应激和饲粮的改变引起肠道功能紊乱、肠道内微生态环境失衡和生长受阻,乳源生长因子的缺乏是引起肠道发育受阻的主要原因之一。表皮生长因子（Epidermal growth factor, EGF）是调节细胞增殖、分化、代谢、存活、凋亡等的一种重要生长因子,是初乳和常乳中最重要的生长因子之一。已有研究表明食品级乳酸乳球菌（Lactococcus lactis, L. lactis）的NICE表达系统在外源蛋白的表达中性能优越。本研究旨在通过乳酸乳球菌作为载体构建表达功能蛋白猪EGF （pEGF）,获得具有生物学活性的重组pEGF,并探索乳酸乳球菌和特异性功能蛋白pEGF的双重效应结合在早期断奶仔猪生产中应用的可行性。本研究包括以下三部分： 试验一猪表皮生长因子（pEGF）成熟蛋白编码区的克隆及序列分析 本试验通过克隆猪egf基因成熟肽编码序列,并与USP45蛋白的信号肽编码序列形成融合片段,通过TA克隆获得pMD19-SPUsp45-MPpEGF质粒,经过菌液PCR分析、双酶切鉴定和测序鉴定USP45蛋白的信号肽编码序列和pegf基... 

【文章页数】：132 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
摘要
Abstract
缩写词表
目录
前言
第一部分 文献综述
    1. 断奶应激对仔猪肠道发育的影响
        1.1 自然断奶
        1.2 早期断奶
        1.3 断奶对仔猪肠道形态发育的影响
        1.4 断奶对仔猪肠道消化酶分泌及活性的影响
        1.5 断奶对仔猪肠道微生物的影响
    2. EGF及其在肠道的稳定性和生物学功能
        2.1 EGF
        2.2 EGF在胃肠道的稳定性
        2.3 EGF受体
        2.4 EGFR在肠道的分布
        2.5 EGF在胃肠道的生物学功能
    3 乳酸乳球菌在基因工程中的应用
        3.1 乳酸菌
        3.2 乳酸乳球菌及其在胃肠道的功能
        3.3 乳酸乳球菌表达系统
        3.4 NICE表达系统
            3.4.1 Nisin的分子结构
            3.4.2 Nisin的生物合成
            3.4.3 NICE系统的表达调控机制
            3.4.4 NICE系统常用的细菌和质粒
            3.4.5 NICE表达系统的应用
第二部分 研究的目的、意义、内容与技术路线
    1 研究目的
    2 研究意义
    3 研究的内容
    4 技术路线
第三部分 试验研究
    试验一 猪表皮生长因子(pEGF)成熟蛋白编码区的克隆及序列分析
        1 引言
        2 材料与方法
            2.1 试验材料
                2.1.1 组织样品采集
                2.1.2 菌株和质粒
                2.1.3 主要试剂
                2.1.4 主要试剂的配制
                2.1.5 主要仪器设备
            2.2 试验方法
                2.2.1 总RNA提取
                2.2.2 RT-PCR
                2.2.3 PCR扩增
                2.2.4 pMD19-SPUsp45-MPpEGF的构建
                2.2.5 E. coli DH5α感受态细胞的制备
                2.2.6 E. coli DH5α的转化
                2.2.7 挑选阳性克隆
                2.2.8 大肠杆菌的质粒提取
                2.2.9 pMD19-SPUsp45-MPpEGF重组质粒的鉴定
        3 试验结果与分析
            3.0 肾脏总RNA的提取
            3.1 SPUsp45-MPpEGF融合片段的扩增
            3.2 重组质粒pMD19-SPUsp45-MPpEGF的构建
                3.2.1 重组质粒pMD19-SPUsp45-MPpEGF的菌液PCR鉴定
                3.2.2 重组质粒pMD19-SPUsp45-MPpEGF的双酶切鉴定
                3.2.3 重组质粒pMD19-SPUsp45-MPpEGF的测序鉴定
        4 讨论
        5 小结
    试验二：pEGF在Lactococcus lactis NZ9000中的分泌表达及活性鉴定
        1 引言
        2 试验材料和方法
            2.1 细菌、细胞及来源
            2.2 主要试剂
            2.3 主要试剂的配制
            2.4 主要仪器设备
            2.5 试验方法
                2.5.1 pMD19-SPUsp45-MPpEGF重组质粒的抽提
                2.5.2 pMD19-SPUsp45-MPpEGF质粒与表达载体pNZ8148双酶切
                2.5.3 DNA片段的连接
                2.5.4 E.coli MC1061感受态细胞的制备
                2.5.5 转化E. coli MC1061感受态细胞
                2.5.6 E. coli MC1061/pNZ8148-SPUsp45-MPpEGF质粒的提取
                2.5.7 pNZ8148-Usp45-MPpEGF重组质粒的鉴定
                2.5.8 E.coli质粒的提取
                2.5.9 乳酸乳球菌NZ9000感受态细胞的制备
                2.5.10 电转化L.lactis NZ9000
                2.5.11 L.lactis NZ9000/pNZ8148-SPUsp45-MPpEGF阳性克隆的筛选及鉴定
                2.5.12 L.lactis NZ9000/pNZ8148-MPUsp45-MPpEGF的诱导表达
                2.5.13 蛋白表达检测
                2.5.14 pEGF的分泌活性鉴定
            2.6 数据分析
        3 试验结果与分析
            3.1 pNZ8148-Usp45-pEGF重组质粒的构建
                3.1.1 pNZ8148-Usp45-pEGF重组质粒的构建
                3.1.2 pMD19-SPUsp45-MPpEGF和pNZ8148双酶切
            3.2 E.coli MC1061/pNZ8148-SPUsp45-MpEGF阳性克隆鉴定
            3.3 L.lactis NZ9000/pNZ8148-SPUsp45-MpEGF重组菌的鉴定
            3.4 L.lactis NZ9000表达的pEGF蛋白检测
            3.5 小鼠成纤维细胞的生长特性
            3.6 rpEGF活性鉴定
                3.6.1 各处理组对小鼠成纤维细胞CCL-1 L929增殖的影响
                3.6.2 BrdU标记法检测重组表达pEGF对CCL-1 L929细胞增殖的影响
        4 讨论
        5 小结
    试验三：添加pEGF基因重组Lactococcus lactis对断奶仔猪肠道健康的影响
        1 引言
        2 材料与方法
            2.1 试验动物
            2.2 试验处理
            2.3 试验基础饲粮
            2.4 圈舍和代谢笼的消毒
            2.5 饲养管理
            2.6 样品的采集和处理
            2.7 测定指标及方法
            2.8 数据分析
        3 试验结果与分析
            3.1 不同处理对仔猪生产性能的影响
            3.2 不同处理对仔猪肠黏膜形态的影响
            3.3 不同处理对仔猪肠道刷状缘酶活的影响
            3.4 不同处理对仔猪肠道菌群的影响
        4 讨论
        5 小结
第四部分 全文总结与研究展望
    1. 总体结论
    2. 本研究的创新点
    3. 有待进一步研究的问题
参考文献
致谢
攻读学位期间发表的论文和科研参与情况


【参考文献】：
期刊论文
[1]不同形式糖对荣昌仔猪小肠黏膜二糖酶活性和养分消化代谢的影响[J]. 兰云贤,杨飞云,汪超,黄金秀,刘作华.  中国畜牧杂志. 2011(13)
[2]不同蛋白源日粮对断奶仔猪小肠形态的影响[J]. 孙云子,余冰,陈代文.  中国饲料. 2011(12)
[3]乳酸菌基因组学研究现状[J]. 颜翼,伦永志.  中华实验和临床感染病杂志(电子版). 2010(02)
[4]BrdU和EGFP标记大鼠骨髓间充质干细胞的对比研究[J]. 刘超,苗雷英,孙新华,孙宏晨,乔春燕.  口腔医学研究. 2009(01)
[5]乳酸乳球菌NZ9000在小鼠体内的定植研究[J]. 唐丽杰,徐毅刚,葛俊伟,任晓峰,汪淼,李一经.  中国乳品工业. 2007(07)
[6]猪表皮生长因子在大肠杆菌中的表达[J]. 杨桂香,黄伟华,彭险峰.  华南农业大学学报. 2006(04)
[7]乳酸乳球菌NICE系统食品级载体pRNB48的构建[J]. 徐波,曹郁生,陈燕,郭兴华.  食品科技. 2006(10)
[8]人工合成苯丙氨酸脱氨酶基因在乳酸乳球菌中的食品级表达[J]. 贾兴元,陈星,苏畅,吕月平,高斌,肖白,刘敬忠.  中华微生物学和免疫学杂志. 2006(01)
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本文编号：3685813