猪徒手克隆技术的优化及Tet1在早期胚胎发育中的变化

发布时间：2022-10-11 16:28

　　随着生物技术的不断发展,体细胞克隆作为一种技术手段已经被广泛应用于转基因动物、物种保护、家畜繁育、异种器官移植以及疾病模型的研究,但是克隆效率低下一直阻碍这一技术发展。一般认为克隆效率低下与重构胚不正确或者不完全的重组而导致的错误表观修饰相关,其中最主要的就是DNA甲基化异常和组蛋白修饰错误。因此如何提高克隆效率对推动这一技术发展有着重要的意义。 1.徒手克隆技术的优化 为提高徒手克隆效率,我们在徒手克隆过程中对克隆胚重构以及胚胎移植都进行了优化。结果发现优化后的囊胚率能达到40%左右,并将235枚桑椹胚及囊胚移植到3头自然发情后4到5天的受体母猪子宫角内,并使两头受体母猪成功怀孕,虽然1头母猪中途不幸流产,但另1头母猪在妊娠后第114天自然分娩产下8只小猪,相对与其他实验室的克隆产子率明显提高。 2.卵母细胞成熟过程及孤雌激活后胚胎发育中Tet1的免疫荧光染色 实验选取成熟0h（GV）、12h、24h、36h和MⅡ时期脱完卵丘的卵母细胞以及孤雌激活（物理+化学）后7.5h、12h、15h、24h和2-cell（36h）胚胎用PFA固定后进行免疫荧光染色。结果发... 

【文章页数】：58 页

【学位级别】：硕士

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目录
摘要
ABSTRACT
英文縮略词表(ABBREVIATION)
第一章 文献综述
    综述1、影响体细胞核移植效率的因素
        1.1 卵巢及其来源
            1.1.1 卵巢受来源母猪品种、年龄影响
            1.1.2 季节变化与卵巢
            1.1.3 卵巢受采集时间和温度影响
        1.2 供体细胞
        1.3 徒手克隆的流程与注意事项
        1.4 受体母猪与胚胎移植
        参考文献
    综述2 5-aza-CdR在体细胞核移植中的应用及甲基化相关基因的研究
        2.1 DNA甲基转移酶的基本作用与特征
        2.2 5-aza-CdR对胚胎发育的影响
        2.3 Tet蛋白家族的结构与功能
        2.4 Tet蛋白家族的生物学作用
        2.5 Dnmts与Tet蛋白家族关系
        参考文献
第二章 实验研究
    第一节 徒手克隆技术的优化
        1 材料与方法
            1.1 实验材料
                1.1.1 仪器
                1.1.2 主要耗材
                1.1.3 溶液配制
                1.1.4 供体细胞
            1.2 试验方法
                1.2.1 卵巢的采集及处理
                1.2.2 卵母细胞体外成熟
                1.2.3 徒手克隆前准备
                1.2.4 脱卵丘
                1.2.5 供体细胞准备
                1.2.6 徒手体细胞核移植技术
                1.2.7 胚胎移植
                1.2.8 妊娠诊断
        2 结果
            2.1 克隆胚胎的生产
            2.2 猪克隆胚胎移植
            2.3 妊娠诊断结果
            2.4 怀孕母猪的分娩
        3 分析与讨论
            3.1 胚胎构建及其胚胎发育
            3.2 关于胚胎移植
            3.3 关于徒手克隆操作
        参考文献
    第二节 Tet1在早期胚胎发育中的变化
        1 材料与方法
            1.1 材料
                1.1.1 实验材料
                1.1.2 试剂
                1.1.3 仪器
                1.1.4 溶液配制
            1.2 方法
                1.2.1 卵巢的采集同第一节
                1.2.2 卵母细胞体外成熟同第一节
                1.2.3 卵母细胞的处理
                1.2.4 冷冻细胞的复苏及培养
                1.2.5 胎儿成纤维细胞的处理
                1.2.6 细胞RNA的提取及反转录
                1.2.7 引物设计与合成
                1.2.8 荧光实时定量PCR检测
                1.2.9 统计分析
                1.2.10 卵母细胞孤雌激活
                1.2.11 间接免疫荧光染色技术
        2 结果
            2.1 卵母细胞成熟及PA早期发育过程中不同时期Tet1的间接免疫荧光染色
            2.2 5-aza-CdR处理对卵母细胞成熟过程中甲基化相关基因表达的影响
            2.3 5-aza-CdR处理对猪胎儿成纤维细胞甲基化相关基因的表达影响
        3 分析与讨论
            3.1 Tet1在卵母细胞成熟过程中及PA后胚胎早期发育过程中的探索
            3.2 5-aza-CdR与Dnmts相关基因的的探讨
            3.3 5-aza-CdR与Tet蛋白家族相关基因的的探讨
        参考文献
全文结论
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]夏季母猪热应激的危害及预防措施[J]. 司马博锋.  养猪. 2011(04)
[2]供体细胞形态、直径和传代次数对猪体细胞核移植效果的影响[J]. 黄雅琼,石德顺,陈旭健,李家洲,曾诗媛,詹萍,阮桂文,赵仕花.  中国兽医科学. 2011(05)
[3]猪的繁殖调控技术(四) 第六讲 猪的胚胎移植技术[J]. 魏庆信.  湖北畜牧兽医. 2010(04)
[4]核移植与供体细胞[J]. 林江维,李劲松.  生命科学. 2009(03)
[5]猪体细胞克隆胚的胚胎移植研究[J]. 戴建军,吴华莉,张廷宇,吴彩凤,李尧,刘吉宏,陈学进,张德福.  上海农业学报. 2007(04)
[6]季节对猪体外成熟卵母细胞的发育能力的影响[J]. 张坤,张运海,潘登科,马育芳,张建,李旭阳,卫恒习,王少华,李燕,戴蕴平,李宁.  自然科学进展. 2007(07)
[7]影响猪卵母细胞体外成熟的相关因素[J]. 张莉,冯书堂.  中国农业科学. 2006(09)
[8]克隆猪的胚胎移植技术及其应用[J]. 李旭阳,邳明伟,孙慧敏,宋志明,潘登科,李宁.  猪业科学. 2006(02)
[9]猪卵巢体外保存温度对卵母细胞染色质构型和成熟能力的影响[J]. 岳奎忠,陈新,孙兴参,李子义,朱赫,卞志明,谭景和.  动物学报. 2005(05)
[10]影响猪卵母细胞体外成熟的相关物理性因素[J]. 文国艺,杨素芳,陈自洪,韦精卫,石德顺.  动物科学与动物医学. 2003(12)



本文编号：3690902