猪miR-15b前体单碱基突变对其生物加工过程的影响

发布时间：2017-05-16 01:06

  本文关键词：猪miR-15b前体单碱基突变对其生物加工过程的影响，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：MicroRNAs(miRNAs)是一类长度为22nt左右的单链非编码RNA,可与靶基因mRNA的3'UTR结合,降解mRNA或抑制mRNA翻译。miR-15b是miR-15/16家族的一员,在细胞增殖、细胞凋亡和细胞周期调控等生物学过程中发挥了重要功能。本研究发现了猪miR-15b前体发生了一个C/T突变,为了探究此突变对miR-15b生物加工过程的影响,分别在体外细胞水平和in vivo水平研究了此突变对miRNA及其前体表达量的影响。随后又探究了mir-15b在猪不同组织中的表达差异性,获得的主要研究结果如下:1.在长白猪和杜洛克猪群体中发现pre-miR-15b第58位碱基发生了一个C/T突变(+58CT),T等位基频率分别为0.03和0.36。荣昌猪群体中没有发现此突变。2.利用Mfold和RNAfold预测突变前后pre-mi R-15b的二级结构及其自由能,结果显示+58CT突变改变了pre-miR-15b的二级结构,并使其自由能下降了11.01%。3.构建野生型(CC)和突变型(TT)pre-miR-15b/mi R-16-1表达载体,分别转染HEK293细胞,随后利用实时荧光定量PCR(qPCR)对miRNA及其前体的表达量进行分析,结果发现转染野生型表达载体的细胞内mi R-15b-5p与miR-16的相对表达量约为转染突变型表达载体的1.6倍(差异极显著,P0.01),且pri-miR-15b与pre-mi R-15b两者总的相对表达量也约为转染突变型表达载体的1.6倍(差异极显著,P0.01),转染突变型表达载体细胞内mi R-15b-3p的相对表达量约为转染野生型表达载体的2.3倍,pri-miR-15b的相对表达量在转染两种不同质粒的细胞内基本相等(差异不显著,P0.05)。进一步分析发现转染野生型表达载体的细胞内miR-15b-5p与miR-15b-3p的比值为11:1,而转染突变型表达载体的比值为3.5:1。4.利用qPCR对突变型和野生型杜洛克猪血液中miR-15b-5p和mi R-15b-3p的表达量进行验证,结果发现野生型猪血液中miR-15b-5p的表达量约为突变型猪的2倍(差异极显著,P0.01),而突变型猪血液中miR-15b-3p的表达量约为野生型猪的5倍(差异极显著,P0.01)。5.利用qPCR检测荣昌猪不同组织内miR-15b-5p的相对表达量,结果显示miR-15b-5p在胸腺和心脏组织高表达,在肝脏组织表达量较低。本研究为进一步研究miR-15b及+58CT突变的生物学功能奠定了基础,同时也为miRNA突变的功能研究提供了新思路。
【关键词】：猪 mi R-15b 前体 突变 表达量 链选择
【学位授予单位】：甘肃农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S828
【目录】：

• 摘要4-6
• Summary6-12
• 第一部分 文献综述12-30
• 1 MiRNA的研究进展12-18
• 1.1 MiRNA的发现12-13
• 1.2 MiRNA家族及其命名13
• 1.3 动物体miRNA的生物加工过程13-18
• 1.3.1 MiRNA的转录13-14
• 1.3.2 细胞核内miRNA的加工过程14-16
• 1.3.3 细胞质中miRNA的加工过程16-17
• 1.3.4 RNA诱导的沉默复合体的形成17-18
• 1.3.5 非经典的miRNA生成途径18
• 1.4 MiRNA的作用机制及其功能18
• 2 MiRNA突变对其功能的影响18-21
• 2.1 MiRNA突变对其加工过程及靶基因选择的影响19-20
• 2.2 MiRNA突变引起诸多人类疾病20-21
• 3 MiR-15b的研究进展21-25
• 3.1 MiR-15a/b家族简介21
• 3.2 MiR-15b的功能21-25
• 3.2.1 MiR-15b对细胞的增殖、分化和凋亡的调控21-23
• 3.2.2 MiR-15b对细胞新陈代谢的调节23
• 3.2.3 MiR-15b在免疫细胞中的功能23-25
• 4 MiRNA的反转录与实时荧光定量PCR25-29
• 4.1 MiRNA成熟体的反转录与qPCR25-28
• 4.2 MiRNA前体的qPCR28-29
• 5 本研究的目的及意义29-30
• 第二部分 试验部分30-65
• 第一章 材料与方法30-49
• 1 试验材料30-33
• 1.1 试验动物30
• 1.2 样品采集30
• 1.3 细胞系及质粒来源30-31
• 1.4 主要仪器设备31
• 1.5 主要试剂31-32
• 1.6 主要溶液及其配制32-33
• 2 试验方法33-49
• 2.1 基因组DNA的提取及检测33-34
• 2.1.1 基因组DNA的提取33-34
• 2.1.2 基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳检测34
• 2.1.3 基因组DNA的分光光度计检测34
• 2.2 基因多态性分析34-35
• 2.2.1 引物设计34
• 2.2.2 PCR反应体系及扩增程序34-35
• 2.2.3 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测35
• 2.2.4 PCR产物的测序35
• 2.3 Pre-miR-15b二级结构及其自由能预测35-36
• 2.4 MiRNA表达载体的构建36-42
• 2.4.1 目的片段的获得36-37
• 2.4.2 重组T载体的构建37-39
• 2.4.3 Pre-miR-15b重组质粒的构建39-42
• 2.5 细胞培养及转染42-44
• 2.5.1 细胞复苏42-43
• 2.5.2 细胞传代43
• 2.5.3 转染43-44
• 2.6 细胞、组织与血液RNA的提取44-46
• 2.6.1 细胞、组织RNA的提取44-45
• 2.6.2 血液RNA的提取45-46
• 2.7 MiRNA的反转录与实时荧光定量PCR46-48
• 2.7.1 MiRNA的反转录46
• 2.7.2 MiRNA及其前体的qPCR46-48
• 2.8 数据处理方法48-49
• 2.8.1 群体遗传分析48
• 2.8.2 荧光定量PCR数据处理48-49
• 第二章 结果与分析49-65
• 1 基因组DNA提取结果49
• 2 基因多态性分析结果49-51
• 2.1 Pre-miR-15b的PCR扩增结果49-50
• 2.2 PCR产物的测序结果50
• 2.3 基因型和等位基因频率及分布50-51
• 3 突变前后pre-miR-15b二级结构及其自由能预测结果51-53
• 4 +58C>T突变对miR-15b表达影响的体外验证试验结果53-61
• 4.1 MiRNA重表达组质粒的获得53-54
• 4.1.1 Pre-miR-15b片段的PCR扩增结果53
• 4.1.2 目的片段的T载体克隆结果53-54
• 4.2 MiRNA重组表达载体的获得54-56
• 4.2.1 双酶切获得目的片段及表达载体片段54-55
• 4.2.2 MiRNA重组质粒的双酶切检测结果55-56
• 4.3 MiRNA表达载体的转染及细胞RNA提取结果56-57
• 4.4 qPCR及miRNA表达量分析结果57-61
• 4.4.1 miR-15b-5p及miR-15b-3p的相对表达量分析结果57-58
• 4.4.2 miR-15b前体的相对表达量分析结果58-59
• 4.4.3 MiR-15b-5p与miR-15b-3p相对表达量的比值分析结果59-60
• 4.4.4 MiR-16的相对表达量分析结果60-61
• 5 +58C>T突变对miR-15b表达影响的体内验证实验结果61-63
• 5.1 新生小猪的基因分型及血液RNA的提取结果61-62
• 5.2 血液中miR-15b-5p/3p的相对表达量检测结果62-63
• 6 猪miR-15b不同组织表达差异性分析结果63-65
• 6.1 猪不同组织RNA提取结果63
• 6.2 MiR-15b不同组织表达差异性分析结果63-65
• 第三部分 讨论65-71
• 1 关于试验方法的讨论65
• 2 猪miR-15b基因的群体多态性及群体遗传学分析65-67
• 3 Pre-miR-15bW/M二级结构及其自由能分析67
• 4 +58C>T突变对pre-miR-15b的表达的影响67-70
• 5 MiR-15b-5p不同组织表达差异性分析70-71
• 第四部分 结论71-72
• 参考文献72-84
• 致谢84-85
• 作者简介85-86
• 导师简介86-87

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