表面展示金黄色葡萄球菌TRAP的大肠杆菌免疫原性及免疫保护性研究

发布时间：2017-05-16 05:13

  本文关键词：表面展示金黄色葡萄球菌TRAP的大肠杆菌免疫原性及免疫保护性研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：奶牛乳房炎是奶牛最常见疾病,由多种病原微生物引起,其中金黄色葡萄球菌和大肠杆菌是两种最为常见的病原菌。随着耐药菌株的大量产生和对抗生素在奶牛乳房炎治疗中的限制,促使人们研究和使用疫苗免疫接种来预防奶牛乳房炎。为了研制一种既可以抗金黄色葡萄球菌感染又可以抵抗大肠杆菌感染的疫苗,本研究将金黄色葡萄球菌的保守性抗原蛋白TRAP用大肠杆菌外膜蛋白OMPC展示在大肠杆菌表面,并研究其免疫原性。实验通过Overlap PCR的方法将金黄色葡萄球菌TRAP蛋白基因与大肠杆菌OmpC基因融合,并分别将OmpC-TRAP和OmpC连接在表达载体pET28a上,构建的质粒命名为pCT和pC。然后将pCT和pC分别转化到大肠杆菌BL21中,获得的阳性表达菌株分别命名为BL21/pCT株和BL21/pC株。用IPTG诱导表达后,获得了与预期分子量一致的蛋白质,进一步进行全菌体蛋白和膜蛋白western-blot分析、全菌体ELISA检测以及激光共聚焦显微镜观察,证实TRAP蛋白展示在大肠杆菌表面。取8周龄ICR小鼠分为4组,即BL21/pCT组、BL21/pC组、TRAP组和PBS组。将抗原BL21/pCT全菌体、BL21/pC全菌体、TRAP蛋白和PBS分别与弗氏完全佐剂以1:1乳化后肌肉注射接种小鼠。初次免疫接种后3周以弗氏不完全佐剂乳化后加强免疫。加强免疫后1周检测脾淋巴细胞产生细胞因子水平;加强免疫后2周检测小鼠血清抗体效价、抗体亚类,并用金黄色葡萄球菌Newman株和HLJ23-1株以及大肠杆菌2002-1株进行攻毒。结果,用金黄色葡萄球菌Newman株、HLJ23-1株和E.coli 2002-1株的攻毒后,PBS对照组小鼠的存活率分别为10%、0、0时,BL21/pCT组小鼠的存活率最高,分别为为70%、70%、40%。重组菌BL21/pCT能够刺激机体产生高水平的抗金黄色葡萄球菌TRAP和大肠杆菌抗体,抗体亚类主要为IgG1和IgG2a;针对金黄色葡萄球菌TRAP和大肠杆菌裂解物刺激,脾淋巴细胞产生高水平的IFN-γ、IL-4和IL-17。结果表明,本实验构建的BL21/PCT成功将金黄色葡萄球菌TRAP展示在大肠杆菌表面,能够诱导小鼠产生较好的细胞免疫应答和体液免疫应答,并诱导小鼠产生良好的抗金黄色葡萄球菌和大肠杆菌感染的免疫保护作用,为进一步研究和开发新型奶牛乳房炎疫苗提供参考。
【关键词】：大肠杆菌 外膜蛋白C 金黄色葡萄球菌 TRAP蛋白 表面展示 奶牛乳房炎疫苗
【学位授予单位】：黑龙江八一农垦大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.4
【目录】：

• 摘要4-5
• Abstract5-9
• 第一章 文献综述9-19
• 1.1 引言9
• 1.2 奶牛乳房炎疫苗的研究进展9-14
• 1.2.1 金黄色葡萄球菌疫苗的研究进展9-13
• 1.2.2 奶牛乳房炎大肠杆菌疫苗研究进展13-14
• 1.3 革兰氏阴性菌表面展示系统的研究进展14-17
• 1.4 研究的目的与意义17-19
• 第二章 表面展示S.aureus TRAP的E.coli BL21菌株构建19-41
• 2.1 材料19-22
• 2.1.1 质粒及菌株19
• 2.1.2 工具酶及化学试剂19-20
• 2.1.3 主要仪器设备20-22
• 2.2 方法22-30
• 2.2.1 引物的设计与合成22
• 2.2.2 模板DNA的获取22-23
• 2.2.3 重组质粒pCT和pC的构建23-29
• 2.2.4 TRAP蛋白表面定位的鉴定29
• 2.2.5 实验数据处理29-30
• 2.3 结果30-38
• 2.3.1 PCR扩增结果30
• 2.3.2 重叠延伸PCR方法融合OmpC和TRAP的基因30-31
• 2.3.3 重组质粒鉴定结果31-32
• 2.3.4 重组菌株BL21/pCT和BL21/pC测序鉴定结果32-36
• 2.3.5 重组菌株BL21/pCT和BL21/pC的生长曲线测定结果36
• 2.3.6 重组菌株Western-blotting检测结果36-37
• 2.3.7 重组菌株全菌体ELISA检测结果37-38
• 2.4 讨论38-41
• 第三章 重组菌株BL21/pCT的免疫原性41-59
• 3.1 材料41
• 3.1.1 菌株和实验动物41
• 3.1.2 工具酶和化学试剂41
• 3.1.3 主要仪器41
• 3.2 方法41-47
• 3.2.1 免疫抗原的制备41-42
• 3.2.2 试验动物分组及免疫接种42-43
• 3.2.3 免疫接种小鼠攻毒43
• 3.2.4 间接ELISA测定抗体水平43-44
• 3.2.5 抗体亚类的检测44-45
• 3.2.6 细胞因子的检测45-47
• 3.2.7 数据统计分析47
• 3.3 结果47-55
• 3.3.1 TRAP蛋白纯化结果47-48
• 3.3.2 小鼠攻毒试验结果48-49
• 3.3.3 血清特异性抗体水平检测结果49-51
• 3.3.4 抗体亚类的检测结果51-52
• 3.3.5 细胞因子检测结果52-55
• 3.4 讨论55-59
• 第四章 全文结论59-61
• 参考文献61-69
• 致谢69-71
• 附录71-77
• 个人简介77

【参考文献】

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本文编号：369633