组成型乳酸菌表达载体的构建及表达效果的比较
发布时间：2022-11-01 21:03
pPG612是一种乳酸菌和大肠杆菌穿梭表达载体,但因其拷贝数较低,而且需要添加诱导剂才能诱导蛋白表达,不方便在生产中进行应用,因此本实验在pPG612表达载体的基础上加以改造,预期得到一个可高水平表达外源蛋白、不需添加诱导物的组成型表面表达载体。 产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）是引起各种动物坏死性肠炎、肠毒血症、人畜创伤性气性坏疽及人类食物中毒的主要病原菌之一,该菌的致病因子是其所产生的外毒素。各型产气荚膜梭菌均产生α毒素（C.perfringens alpha-toxin, CPA）,它是产气荚膜梭菌最重要的致病毒素之一,利用构建的组成型乳酸菌表达载体对去毒后的α毒素进行表达,筛选高表达量的组成型乳酸菌表达载体系统,为构建新型重组乳酸菌活菌疫苗防治该病提供物质基础。 本实验中,构建了一个无需诱导的可表面表达a毒素蛋白的干酪乳杆菌组成型表达载体。以pPG612载体质粒为基本框架,将其原有表达元件替换为HCE启动子、PgsA anchor、 rrnBT1T2终止子,改造后载体命名为pPG-PPT,将α毒素基因片段插入到表达载体pPG-PPT中,...
【文章页数】：75 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
CONTENTS
摘要
Abstract
1 前言
1.1 乳酸菌作为载体疫苗的研究进展
1.1.1 乳酸菌的应用
1.1.2 乳酸菌的肠道黏附作用
1.1.3 干酪乳杆菌
1.2 组成型与诱导型表达载体的研究进展
1.3 乳酸菌载体表达元件
1.3.1 乳酸菌表达载体的构成
1.3.2 本实验中组成型表达盒的构成元件
1.4 翻译增强子的简介及其在表达载体中的应用
1.4.1 转录增强子
1.4.2 翻译增强子
1.5 产气荚膜梭菌α毒素的研究进展
1.6 实时荧光定量PCR方法的应用
1.7 流式细胞术在基因表达分析中的应用
1.8 研究目的及意义
2 材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 质粒与菌种
2.1.2 抗体制剂
2.1.3 实验动物
2.1.4 引物
2.1.5 主要生物学试剂
2.1.6 培养基
2.1.7 主要仪器与设备
2.2 试验方法
2.2.1 目的基因的获得
2.2.2 PgsA anchor多克隆抗体的制备
2.2.3 重组干酪乳杆菌表达系统构建
2.2.4 重组干酪乳杆菌PgsA anchor和α毒素融合表达蛋白鉴定
2.2.5 重组干酪乳杆菌表达载体的优化
2.2.6 优化后重组菌蛋白表达的鉴定及其与优化前重组菌蛋白表达情况的比较分析
3 结果
3.1 目的基因的克隆与序列测定
3.1.1 目的基因的PCR扩增结果
3.1.2 重组质粒的双酶切鉴定结果
3.2 PgsA anchor多克隆抗体的制备
3.2.1 原核表达载体pET-32a-PgsA的构建
3.2.2 PgsA anchor基因在大肠杆菌中表达产物的SDS-PAGE鉴定
3.2.3 重组蛋白表达鉴定及纯化
3.2.4 间接ELISA检测重组PgsA anchor抗血清效价
3.3 重组干酪乳杆菌表达系统的构建
3.3.1 重组干酪乳杆菌表达载体pPG-PPT与pPG-PPαT的构建图谱
3.3.2 表达α毒素的重组干酪乳杆菌的构建
3.4 重组干酪乳杆菌PgsA anchor和α毒素融合表达蛋白的鉴定
3.4.1 表达产物的SDS-PAGE鉴定
3.4.2 表达产物的Western Blot鉴定
3.5 重组干酪乳杆菌表达载体的优化
3.5.1 重组质粒pMD18-TS-T7g10、pMD18-TS-Ω的酶切鉴定
3.5.2 重组菌pPG-T7g10-PPαT/TG1、pPG-Ω-PPαT/TG1的鉴定
3.5.3 重组干酪乳杆菌pPG-T7g1 0-PPαT/L.casei 393、pPG-Ω-PPαT/L.casei 393
3.6 优化后重组菌蛋白表达的鉴定及其与优化前重组菌蛋白表达情况的比较分析
3.6.1 表达产物的Western Blot鉴定
3.6.2 表达产物的间接ELISA鉴定
3.6.3 重组菌中mRNA荧光定量PCR相对定量分析
3.6.4 表达产物流式细胞术检测
3.6.5 表达产物的间接免疫荧光定位检测
3.6.6 表达产物的激光共聚焦定位检测
4 讨论
4.1 PgsA anchor与α毒素蛋白融合表达
4.2 T7g10与omega增强子的插入
4.3 三种重组菌α毒素蛋白表达量ELISA结果比较分析
4.4 三种重组菌mRNA转录水平比较分析
4.5 重组菌的蛋白表达量流式细胞术结果比较分析
4.6 重组菌表面表达蛋白的间接免疫荧光与激光共聚焦分析
4.7 荧光定量PCR方法的应用
4.8 组成型乳酸菌表面表达载体的应用前景
5 结论
致谢
参考文献
附录
攻读硕士学位期间发表的学术论文
【参考文献】：
期刊论文
[1]LUNX基因增强子的克隆及调控活性分析[J]. 邓永键,王爽,郑林,唐娜,肖小琴. 南方医科大学学报. 2010(09)
[2]产气荚膜梭菌青海分离株α毒素基因克隆与表达[J]. 王光华,周继章,蔺国珍,郑福英,曹小安,邱昌庆. 浙江农业学报. 2010(02)
[3]产气荚膜梭菌α毒素在干酪乳杆菌中的诱导表达及其小鼠口服免疫力[J]. 李晓静,夏春丽,李一经. 微生物学报. 2009(08)
[4]乳酸菌在基因工程领域的应用[J]. 王璠,元冬娟,江黎明. 生命的化学. 2008(03)
[5]乳杆菌质粒基因工具的发展概况[J]. 刘红娟,孟祥晨. 中国乳品工业. 2008(05)
[6]猪细小病毒VP2蛋白在干酪乳杆菌表面的表达[J]. 徐义刚,崔丽春,马广鹏,唐丽杰,葛俊伟,夏春丽,乔薪媛,赵丽丽,李一经. 生物工程学报. 2007(02)
[7]hCGβ-C3d3融合蛋白在乳酸杆菌的表达及鉴定[J]. 姚晓英,李大金,袁敏敏. 生殖医学杂志. 2006(05)
[8]产气荚膜梭菌α毒素研究进展[J]. 赵宝华,杨虹,顾为望. 河北师范大学学报. 2002(05)
[9]A型产气荚膜梭菌α毒素分子生物学的研究进展[J]. 许崇波. 宁夏大学学报(自然科学版). 2002(02)
[10]产气荚膜梭菌α毒素保护性抗原基因的克隆与核苷酸序列分析[J]. 许崇波,朱平,姚湘燕,王卓,冯书章,马从林,孟锐奇. 中国兽医学报. 1998(02)
本文编号：3700096
【文章页数】：75 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
CONTENTS
摘要
Abstract
1 前言
1.1 乳酸菌作为载体疫苗的研究进展
1.1.1 乳酸菌的应用
1.1.2 乳酸菌的肠道黏附作用
1.1.3 干酪乳杆菌
1.2 组成型与诱导型表达载体的研究进展
1.3 乳酸菌载体表达元件
1.3.1 乳酸菌表达载体的构成
1.3.2 本实验中组成型表达盒的构成元件
1.4 翻译增强子的简介及其在表达载体中的应用
1.4.1 转录增强子
1.4.2 翻译增强子
1.5 产气荚膜梭菌α毒素的研究进展
1.6 实时荧光定量PCR方法的应用
1.7 流式细胞术在基因表达分析中的应用
1.8 研究目的及意义
2 材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 质粒与菌种
2.1.2 抗体制剂
2.1.3 实验动物
2.1.4 引物
2.1.5 主要生物学试剂
2.1.6 培养基
2.1.7 主要仪器与设备
2.2 试验方法
2.2.1 目的基因的获得
2.2.2 PgsA anchor多克隆抗体的制备
2.2.3 重组干酪乳杆菌表达系统构建
2.2.4 重组干酪乳杆菌PgsA anchor和α毒素融合表达蛋白鉴定
2.2.5 重组干酪乳杆菌表达载体的优化
2.2.6 优化后重组菌蛋白表达的鉴定及其与优化前重组菌蛋白表达情况的比较分析
3 结果
3.1 目的基因的克隆与序列测定
3.1.1 目的基因的PCR扩增结果
3.1.2 重组质粒的双酶切鉴定结果
3.2 PgsA anchor多克隆抗体的制备
3.2.1 原核表达载体pET-32a-PgsA的构建
3.2.2 PgsA anchor基因在大肠杆菌中表达产物的SDS-PAGE鉴定
3.2.3 重组蛋白表达鉴定及纯化
3.2.4 间接ELISA检测重组PgsA anchor抗血清效价
3.3 重组干酪乳杆菌表达系统的构建
3.3.1 重组干酪乳杆菌表达载体pPG-PPT与pPG-PPαT的构建图谱
3.3.2 表达α毒素的重组干酪乳杆菌的构建
3.4 重组干酪乳杆菌PgsA anchor和α毒素融合表达蛋白的鉴定
3.4.1 表达产物的SDS-PAGE鉴定
3.4.2 表达产物的Western Blot鉴定
3.5 重组干酪乳杆菌表达载体的优化
3.5.1 重组质粒pMD18-TS-T7g10、pMD18-TS-Ω的酶切鉴定
3.5.2 重组菌pPG-T7g10-PPαT/TG1、pPG-Ω-PPαT/TG1的鉴定
3.5.3 重组干酪乳杆菌pPG-T7g1 0-PPαT/L.casei 393、pPG-Ω-PPαT/L.casei 393
3.6 优化后重组菌蛋白表达的鉴定及其与优化前重组菌蛋白表达情况的比较分析
3.6.1 表达产物的Western Blot鉴定
3.6.2 表达产物的间接ELISA鉴定
3.6.3 重组菌中mRNA荧光定量PCR相对定量分析
3.6.4 表达产物流式细胞术检测
3.6.5 表达产物的间接免疫荧光定位检测
3.6.6 表达产物的激光共聚焦定位检测
4 讨论
4.1 PgsA anchor与α毒素蛋白融合表达
4.2 T7g10与omega增强子的插入
4.3 三种重组菌α毒素蛋白表达量ELISA结果比较分析
4.4 三种重组菌mRNA转录水平比较分析
4.5 重组菌的蛋白表达量流式细胞术结果比较分析
4.6 重组菌表面表达蛋白的间接免疫荧光与激光共聚焦分析
4.7 荧光定量PCR方法的应用
4.8 组成型乳酸菌表面表达载体的应用前景
5 结论
致谢
参考文献
附录
攻读硕士学位期间发表的学术论文
【参考文献】：
期刊论文
[1]LUNX基因增强子的克隆及调控活性分析[J]. 邓永键,王爽,郑林,唐娜,肖小琴. 南方医科大学学报. 2010(09)
[2]产气荚膜梭菌青海分离株α毒素基因克隆与表达[J]. 王光华,周继章,蔺国珍,郑福英,曹小安,邱昌庆. 浙江农业学报. 2010(02)
[3]产气荚膜梭菌α毒素在干酪乳杆菌中的诱导表达及其小鼠口服免疫力[J]. 李晓静,夏春丽,李一经. 微生物学报. 2009(08)
[4]乳酸菌在基因工程领域的应用[J]. 王璠,元冬娟,江黎明. 生命的化学. 2008(03)
[5]乳杆菌质粒基因工具的发展概况[J]. 刘红娟,孟祥晨. 中国乳品工业. 2008(05)
[6]猪细小病毒VP2蛋白在干酪乳杆菌表面的表达[J]. 徐义刚,崔丽春,马广鹏,唐丽杰,葛俊伟,夏春丽,乔薪媛,赵丽丽,李一经. 生物工程学报. 2007(02)
[7]hCGβ-C3d3融合蛋白在乳酸杆菌的表达及鉴定[J]. 姚晓英,李大金,袁敏敏. 生殖医学杂志. 2006(05)
[8]产气荚膜梭菌α毒素研究进展[J]. 赵宝华,杨虹,顾为望. 河北师范大学学报. 2002(05)
[9]A型产气荚膜梭菌α毒素分子生物学的研究进展[J]. 许崇波. 宁夏大学学报(自然科学版). 2002(02)
[10]产气荚膜梭菌α毒素保护性抗原基因的克隆与核苷酸序列分析[J]. 许崇波,朱平,姚湘燕,王卓,冯书章,马从林,孟锐奇. 中国兽医学报. 1998(02)
本文编号：3700096
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