牛丘疹性口炎病毒的分离、全基因组测序及其生物信息学分析
发布时间：2022-12-04 02:27
牛丘疹性口炎病（BPS）是牛的一种高度传染性的、普遍存在的疾病,该病由牛丘疹性口炎病毒引起。它是能引起牛和人的一种急性、接触性、嗜上皮性传染病。牛丘疹性口炎病的特点是常在皮肤或嘴唇的粘膜,齿垫,上颚,舌头,乳房,口角出现丘疹和溃疡。在牛丘疹性口炎流行地区,发病率可高达90%以上,死亡率较低,但能使牛哺乳期中断和产奶量下降,影响牛肉和皮的品质,还会引起续发感染。国内外对该病的致病机理还没有系统的研究和报道,基因组序列的数据稀少,有关基因功能的研究更加稀少,因此我们希望能够通过我们的研究,为牛丘疹性口炎病的研究提供一定的基础。主要研究内容如下：1.通过观察牛病理特征,采集病料做病理切片,病毒接种于细胞分离,病毒形态电镜显示成卵圆形,以及PCR的特异性检测,基因产物的测序和比对,检测和分离到了牛丘疹性口炎病毒三岁的安格斯公牛,已有两个月的慢性肩部感染,颈部、腹部皮肤有突起的结节,尸检肩部出现脓肿脓液,多个浅表淋巴结肿大。并且在牛前肢两侧末端皮肤有慢性皮肤增殖病和肿胀。四肢皮肤广泛性病理增生,皮肤溃疡出血病有灶融合。 组织病理学检查显示前肢上皮乳头状增生、过度角质化、真皮炎症浸润。角化细胞气球...
【文章页数】：126 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
常用英文缩略词汇
第一章 文献综述
1. 牛丘疹性口炎病毒的研究进展
1.1 牛丘疹性口炎病毒流行病学特征
1.2 临床症状
1.3 病毒基因组结构
1.4 主要的毒力基因
1.4.1 BPSV-ORF006基因
1.4.2 BPSV-ORF080基因
1.4.3 BPSV-ORF102和BPSV-ORF103基因
1.4.4 BPSV-ORF109和BPSV-ORF110基因
1.4.5 BPSV-ORF112基因
1.4.6 BPSV-ORF117基因
1.4.7 BPSV-ORF127基因
1.5 免疫治疗和重组疫苗
2. 痘病毒的免疫防御分子
2.1 细胞外防御蛋白
2.1.1 补体调节蛋白
2.1.2 干扰素结合蛋白
2.1.3 IL-18结合蛋白(IL-18 BPs)
2.1.4 可溶性肿瘤坏死因子结合蛋白
2.1.5 可溶性IL-1β同源受体
2.1.6 趋化因子抑制剂
2.1.7 其他的细胞因子结合蛋白和其同源物
2.1.8 分泌的自然杀伤细胞抑制剂
2.2 细胞内防御蛋白
2.2.1 细胞模式识别受体的信号通路的抑制剂
2.2.2 NF-κB信号转导通路抑制剂
2.2.3 肿瘤坏死因子信号通路(IFN)的抑制剂
2.2.4 抑制细胞凋亡的分子
2.2.5 抑制抗原递呈的分子
第二章 牛丘疹性口炎病毒的分离
1. 材料
1.1 主要试剂
1.2 主要仪器
2. 方法
2.1 流行情况及临床症状
2.2 样品的采集
2.3 病理组织学切片的制作
2.3.1 固定
2.3.2 脱水
2.3.3 透明
2.3.4 浸蜡
2.3.5 包埋
2.3.6 切片
2.3.7 脱蜡
2.3.8 HE染色
2.4 病毒的初步分离培养
2.5 病毒的电镜观察
2.6 PCR检测目的基因
3. 试验结果与分析
3.1 流行情况及临床症状
3.2 组织切片鉴定
3.3 病毒的初步分离培养结果
3.4 病毒粒子电镜图
3.5 PCR扩增产物和测序结果
4 讨论
5 小结
第三章 牛丘疹性口炎病毒全基因组测序与C5、C15和C1病毒的分离纯化
1. 材料
1.1 细胞和病毒
1.2 主要试剂
1.3 主要试剂盒
1.4 主要仪器
2. 方法
2.1 病毒TX09全基因测序
2.1.1 病毒TX09基因的抽提
2.1.2 病毒DNA测序
2.2 C5、C15病毒的纯化
2.2.1 引物的设计和酶切位点的选择
2.2.2 蚀斑筛选
2.2.3 病毒的增殖
2.2.4 病毒DNA检测
2.2.5 阳性克隆的筛选
2.3 C1病毒的纯化
2.3.1 引物的设计
2.3.2 蚀斑筛选
2.3.3 病毒的增殖
2.3.4 样品DNA的抽提
2.3.5 PCR检测目的条带
2.3.6 阳性克隆的筛选
3. 实验结果和分析
3.1 C5、C15病毒的纯化
3.2 C1病毒的纯化
4. 讨论
5. 小结
第四章 牛丘疹性口炎病毒C15、C5和C1开放阅读框的标注
1. 材料和方法
1.1 实验病毒基因序列
1.2 实验软件及数据库
2 实验方法
3 结果与分析
3.1 C15,C5,C1病毒同源性比对
3.2 C15,C5,C1病毒开放阅读框的确定
3.3 密码子偏爱性分析
4. 讨论
5. 小结
第五章 牛丘疹性口炎病毒C15、C5和C1差异开放阅读框的比对
1. 材料
1.1 病毒
1.2 主要使用的软件
2 方法
3. 结果与分析
4. 讨论
5. 小结
第六章 C5、C15和C1病毒动物接种试验
1. 材料
1.1 细胞、病毒和实验动物
1.2 主要试剂
1.3 主要试剂盒
1.4 主要仪器
2. 方法
2.1 病毒的增殖
2.2 病毒C5、C15、C1细胞培养物TCID_(50)的测定
2.3 生长曲线的绘制
2.3.1 多步增长特性(MOI=0.1)
2.3.2 一步增长特性(病毒MOI=10)
2.4 动物接种试验
3. 结果与分析
3.1 病毒C5、C15、C1细胞培养物TCID_(50)的测定
3.2 生长曲线的测定
3.3 动物接种试验
4 讨论
5 小结
第七章 酵母双杂交初步筛选与C1-ORF118相互作用的蛋白
1. 材料
1.1 载体及菌株
1.2 主要试剂的配制
1.3 主要试剂盒
1.4 主要仪器
2. 方法
2.1 重组质粒的构
2.1.1 ORFV 118基因的扩增
2.1.2 双酶切酵母载体pGBK7-BD
2.1.3 PCR产物和双酶切酵母载体pGBK7-BD的纯化
2.1.4 ORFV118的连接和转化
2.1.5 提取质粒DNA
2.1.6 ORFV118重组质粒的鉴定
2.1.7 ORFV118重组质粒的测序
2.2 酵母双杂交试验
2.2.1 Y2HGold和Y187酵母感受态的制备
2.2.2 酵母细胞转化试验
2.2.3 pGBK7-118菌株与酵母双杂交cDNA文库中筛选相互作用蛋白
2.2.4 阳性克隆的鉴定
2.2.5 酵母细胞质粒的大肠杆菌转化试验
2.2.6 提取质粒DNA
3. 阳性质粒基因测序
4. 试验结果与分析
4.1. 病毒ORFV118基因的扩增
4.2 酵母载体酶切
4.3 重组质粒的鉴定
4.4 重组诱饵质粒pGBKT7-118的毒性及自激活检测
4.5. 诱饵质粒pGBKT7-118和文库酵母双杂交筛选
5. 讨论
6. 小结
全文总结
本论文的创新点
参考文献
致谢
攻读学位期间发表的学术论文
【参考文献】：
期刊论文
[1]疑似牛传染性口炎的诊治[J]. 蓝泽清. 福建畜牧兽医. 2014(02)
[2]水牛丘疹性口炎的诊断[J]. 陈锡全,刘万钧,杨晓梅,敖学成,姚梓才,向淑华,徐华,党联银. 四川畜牧兽医. 1986(03)
本文编号：3707434
【文章页数】：126 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
常用英文缩略词汇
第一章 文献综述
1. 牛丘疹性口炎病毒的研究进展
1.1 牛丘疹性口炎病毒流行病学特征
1.2 临床症状
1.3 病毒基因组结构
1.4 主要的毒力基因
1.4.1 BPSV-ORF006基因
1.4.2 BPSV-ORF080基因
1.4.3 BPSV-ORF102和BPSV-ORF103基因
1.4.4 BPSV-ORF109和BPSV-ORF110基因
1.4.5 BPSV-ORF112基因
1.4.6 BPSV-ORF117基因
1.4.7 BPSV-ORF127基因
1.5 免疫治疗和重组疫苗
2. 痘病毒的免疫防御分子
2.1 细胞外防御蛋白
2.1.1 补体调节蛋白
2.1.2 干扰素结合蛋白
2.1.3 IL-18结合蛋白(IL-18 BPs)
2.1.4 可溶性肿瘤坏死因子结合蛋白
2.1.5 可溶性IL-1β同源受体
2.1.6 趋化因子抑制剂
2.1.7 其他的细胞因子结合蛋白和其同源物
2.1.8 分泌的自然杀伤细胞抑制剂
2.2 细胞内防御蛋白
2.2.1 细胞模式识别受体的信号通路的抑制剂
2.2.2 NF-κB信号转导通路抑制剂
2.2.3 肿瘤坏死因子信号通路(IFN)的抑制剂
2.2.4 抑制细胞凋亡的分子
2.2.5 抑制抗原递呈的分子
第二章 牛丘疹性口炎病毒的分离
1. 材料
1.1 主要试剂
1.2 主要仪器
2. 方法
2.1 流行情况及临床症状
2.2 样品的采集
2.3 病理组织学切片的制作
2.3.1 固定
2.3.2 脱水
2.3.3 透明
2.3.4 浸蜡
2.3.5 包埋
2.3.6 切片
2.3.7 脱蜡
2.3.8 HE染色
2.4 病毒的初步分离培养
2.5 病毒的电镜观察
2.6 PCR检测目的基因
3. 试验结果与分析
3.1 流行情况及临床症状
3.2 组织切片鉴定
3.3 病毒的初步分离培养结果
3.4 病毒粒子电镜图
3.5 PCR扩增产物和测序结果
4 讨论
5 小结
第三章 牛丘疹性口炎病毒全基因组测序与C5、C15和C1病毒的分离纯化
1. 材料
1.1 细胞和病毒
1.2 主要试剂
1.3 主要试剂盒
1.4 主要仪器
2. 方法
2.1 病毒TX09全基因测序
2.1.1 病毒TX09基因的抽提
2.1.2 病毒DNA测序
2.2 C5、C15病毒的纯化
2.2.1 引物的设计和酶切位点的选择
2.2.2 蚀斑筛选
2.2.3 病毒的增殖
2.2.4 病毒DNA检测
2.2.5 阳性克隆的筛选
2.3 C1病毒的纯化
2.3.1 引物的设计
2.3.2 蚀斑筛选
2.3.3 病毒的增殖
2.3.4 样品DNA的抽提
2.3.5 PCR检测目的条带
2.3.6 阳性克隆的筛选
3. 实验结果和分析
3.1 C5、C15病毒的纯化
3.2 C1病毒的纯化
4. 讨论
5. 小结
第四章 牛丘疹性口炎病毒C15、C5和C1开放阅读框的标注
1. 材料和方法
1.1 实验病毒基因序列
1.2 实验软件及数据库
2 实验方法
3 结果与分析
3.1 C15,C5,C1病毒同源性比对
3.2 C15,C5,C1病毒开放阅读框的确定
3.3 密码子偏爱性分析
4. 讨论
5. 小结
第五章 牛丘疹性口炎病毒C15、C5和C1差异开放阅读框的比对
1. 材料
1.1 病毒
1.2 主要使用的软件
2 方法
3. 结果与分析
4. 讨论
5. 小结
第六章 C5、C15和C1病毒动物接种试验
1. 材料
1.1 细胞、病毒和实验动物
1.2 主要试剂
1.3 主要试剂盒
1.4 主要仪器
2. 方法
2.1 病毒的增殖
2.2 病毒C5、C15、C1细胞培养物TCID_(50)的测定
2.3 生长曲线的绘制
2.3.1 多步增长特性(MOI=0.1)
2.3.2 一步增长特性(病毒MOI=10)
2.4 动物接种试验
3. 结果与分析
3.1 病毒C5、C15、C1细胞培养物TCID_(50)的测定
3.2 生长曲线的测定
3.3 动物接种试验
4 讨论
5 小结
第七章 酵母双杂交初步筛选与C1-ORF118相互作用的蛋白
1. 材料
1.1 载体及菌株
1.2 主要试剂的配制
1.3 主要试剂盒
1.4 主要仪器
2. 方法
2.1 重组质粒的构
2.1.1 ORFV 118基因的扩增
2.1.2 双酶切酵母载体pGBK7-BD
2.1.3 PCR产物和双酶切酵母载体pGBK7-BD的纯化
2.1.4 ORFV118的连接和转化
2.1.5 提取质粒DNA
2.1.6 ORFV118重组质粒的鉴定
2.1.7 ORFV118重组质粒的测序
2.2 酵母双杂交试验
2.2.1 Y2HGold和Y187酵母感受态的制备
2.2.2 酵母细胞转化试验
2.2.3 pGBK7-118菌株与酵母双杂交cDNA文库中筛选相互作用蛋白
2.2.4 阳性克隆的鉴定
2.2.5 酵母细胞质粒的大肠杆菌转化试验
2.2.6 提取质粒DNA
3. 阳性质粒基因测序
4. 试验结果与分析
4.1. 病毒ORFV118基因的扩增
4.2 酵母载体酶切
4.3 重组质粒的鉴定
4.4 重组诱饵质粒pGBKT7-118的毒性及自激活检测
4.5. 诱饵质粒pGBKT7-118和文库酵母双杂交筛选
5. 讨论
6. 小结
全文总结
本论文的创新点
参考文献
致谢
攻读学位期间发表的学术论文
【参考文献】：
期刊论文
[1]疑似牛传染性口炎的诊治[J]. 蓝泽清. 福建畜牧兽医. 2014(02)
[2]水牛丘疹性口炎的诊断[J]. 陈锡全,刘万钧,杨晓梅,敖学成,姚梓才,向淑华,徐华,党联银. 四川畜牧兽医. 1986(03)
本文编号：3707434
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