表达鹅细小病毒VP3基因重组腺病毒的构建及鉴定
发布时间：2022-12-04 09:50
目的基因,构建表达质粒pET-30a-VP3,并在大肠杆菌BL-21（DE3）中获得表达,对表达蛋白进行SDS-PAGE和’Western-blot鉴定,将纯化后的融合蛋白免疫健康家兔,制备兔抗GPV-VP3蛋白多克隆抗体,通过间接ELISA测定抗体效价。结果表明,本研究成功构建了原核表达载体pET-30a-VP3,分子质量大小约为60Ku,具有良好的反应原性；成功制备了兔抗GPV-VP3蛋白多克隆抗体,抗体效价为1：200。 2、GPV-VP3基因重组腺病毒的构建及鉴定。 为了构建GPV-VP3基因重组腺病毒载体,本试验利用PCR扩增得到《GPV-VP3基因,采用基因重组技术构建了High-VP3转移载体,通过脂质体介导的方式将该重组质粒与腺病毒Ad5共转染QBI-HEK293细胞,待细胞出现病变（CPE）后,采用反复冻融的方式收获重组病毒,进行重组病毒VP3基因的PCR鉴定,并利用间接免疫荧光（IFA）试验及Western blot试验对重组病毒进行检测,分析重组病毒VP3基因的抗病毒活性。结果显示,成功制备了表达GPV-VP3基因的重组腺病毒（rAd-VP3）,其病毒...
【文章页数】：37 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
前言
材料与方法
1 试验材料
1.1 实验动物
1.2 载体及主要试剂
1.3 主要仪器设备
1.4 试验所需溶液及其配制
2 试验方法
2.1 设计与合成引物
2.2 PCR扩增鹅VP3基因
2.3 VP3基因纯化回收
2.4 VP3基因的TA克隆
2.5 转化
2.6 提取克隆质粒
2.7 克隆质粒的鉴定
2.8 构建并鉴定pET-30a-VP3表达质粒
2.9 表达质粒的诱导及表达形式鉴定
2.10 重组蛋白纯化
2.11 多克隆抗体制备
2.12 多克隆抗体的鉴定
2.13 多克隆抗体效价检测
2.14 QBI-HEK-293细胞的复苏
2.15 Ad5扩大培养
2.16 引物的设计与合成
2.17 重组腺病毒穿梭质粒pCR259-VP3的构建
2.18 重组腺病毒质粒High-VP3的构建
2.19 重组腺病毒rAd-VP3的制备
2.20 rAd-VP3的Rt-PCR鉴定
2.21 IFAT检测VP3基因在rAd-VP3中的表达
2.22 Western-blot分析
2.23 重组腺病毒rAd-VP3 TCID_(50)的测定
结果
3.1 鹅细小病毒VP3基因的PCR扩增及克隆质粒的鉴定
3.2 鉴定表达质粒pET-30a-VP3
3.3 重组质粒诱导表达
3.4 重组蛋白存在形式鉴定
3.5 重组蛋白纯化
3.6 重组蛋白Western-blot分析
3.7 多克隆抗体效价测定
3.8 重组腺病毒穿梭质粒pCR259-VP3的鉴定
3.9 重组腺病毒质粒High-VP3的鉴定
3.10 重组腺病毒rAd-VP3的制备
3.11 rAd-VP3的Rt-PCR鉴定
3.12 IFAT检测VP3基因在rAd-VP3中的表达
3.13 Western-blot分析
3.14 重组腺病毒rAd-VP3病毒滴度测定
讨论
结论
参考文献
致谢
作者简介
【参考文献】：
期刊论文
[1]猪链球菌2型MRP和EF双基因共表达重组腺病毒载体的构建[J]. 汪涛,余辉,梅钧,李兴暖,周小鸥,赵志军. 生物技术通报. 2013(08)
[2]2株鹅细小病毒全基因组特征分析[J]. 王浩,田先举,张烁,周秀红,刘红梅,潘玲,祁克宗. 畜牧兽医学报. 2013(04)
[3]共表达鹅细小病毒VP3-gIL2重组乳酸杆菌的构建及其口服免疫评价[J]. 丁轲,余祖华,李旺,闫文朝,王臣,赵战勤,程相朝,张春杰,王天奇,程安春,汪铭书. 畜牧兽医学报. 2013(02)
[4]表达鹅α干扰素基因重组禽痘病毒的构建及表达产物抑制鹅细小病毒活性的初步研究[J]. 张颖,高旭,陈海迪,鲁承. 中国预防兽医学报. 2012(12)
[5]猪流行性腹泻病毒重组腺病毒疫苗的构建及小鼠免疫试验[J]. 焦茂兴,吴锋,刘德辉,黄毓茂. 中国畜牧兽医. 2012(02)
[6]鹅细小病毒CHv强毒株VP3基因克隆及遗传进化[J]. 丁轲,程安春,张智信,汪铭书,余祖华,程相朝. 河南科技大学学报(自然科学版). 2011(06)
[7]霍尔多巴吉鹅源小鹅瘟病毒VP3基因的克隆及序列分析[J]. 董浩,段小波,单晓枫,胡桂学. 中国兽医杂志. 2011(10)
[8]鹅细小病毒不同毒株VP13基因的克隆与序列分析[J]. 韦艳梅,曹宗喜,廖明,张桂红,郑煦灿,单芬,罗开健. 动物医学进展. 2010(08)
[9]鹅细小病毒延边株VP3基因真核表达质粒构建[J]. 杜秋明,鲁承,王暖成. 江苏农业科学. 2010(03)
[10]靶向新城疫病毒NP基因的shRNA重组腺病毒表达载体的构建及鉴定[J]. 杨帆,岳华,侯巍,汤承. 中国预防兽医学报. 2010(01)
硕士论文
[1]鹅细小病毒病油乳剂灭活疫苗的研制[D]. 李琳.吉林大学 2008
本文编号：3708035
【文章页数】：37 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
前言
材料与方法
1 试验材料
1.1 实验动物
1.2 载体及主要试剂
1.3 主要仪器设备
1.4 试验所需溶液及其配制
2 试验方法
2.1 设计与合成引物
2.2 PCR扩增鹅VP3基因
2.3 VP3基因纯化回收
2.4 VP3基因的TA克隆
2.5 转化
2.6 提取克隆质粒
2.7 克隆质粒的鉴定
2.8 构建并鉴定pET-30a-VP3表达质粒
2.9 表达质粒的诱导及表达形式鉴定
2.10 重组蛋白纯化
2.11 多克隆抗体制备
2.12 多克隆抗体的鉴定
2.13 多克隆抗体效价检测
2.14 QBI-HEK-293细胞的复苏
2.15 Ad5扩大培养
2.16 引物的设计与合成
2.17 重组腺病毒穿梭质粒pCR259-VP3的构建
2.18 重组腺病毒质粒High-VP3的构建
2.19 重组腺病毒rAd-VP3的制备
2.20 rAd-VP3的Rt-PCR鉴定
2.21 IFAT检测VP3基因在rAd-VP3中的表达
2.22 Western-blot分析
2.23 重组腺病毒rAd-VP3 TCID_(50)的测定
结果
3.1 鹅细小病毒VP3基因的PCR扩增及克隆质粒的鉴定
3.2 鉴定表达质粒pET-30a-VP3
3.3 重组质粒诱导表达
3.4 重组蛋白存在形式鉴定
3.5 重组蛋白纯化
3.6 重组蛋白Western-blot分析
3.7 多克隆抗体效价测定
3.8 重组腺病毒穿梭质粒pCR259-VP3的鉴定
3.9 重组腺病毒质粒High-VP3的鉴定
3.10 重组腺病毒rAd-VP3的制备
3.11 rAd-VP3的Rt-PCR鉴定
3.12 IFAT检测VP3基因在rAd-VP3中的表达
3.13 Western-blot分析
3.14 重组腺病毒rAd-VP3病毒滴度测定
讨论
结论
参考文献
致谢
作者简介
【参考文献】：
期刊论文
[1]猪链球菌2型MRP和EF双基因共表达重组腺病毒载体的构建[J]. 汪涛,余辉,梅钧,李兴暖,周小鸥,赵志军. 生物技术通报. 2013(08)
[2]2株鹅细小病毒全基因组特征分析[J]. 王浩,田先举,张烁,周秀红,刘红梅,潘玲,祁克宗. 畜牧兽医学报. 2013(04)
[3]共表达鹅细小病毒VP3-gIL2重组乳酸杆菌的构建及其口服免疫评价[J]. 丁轲,余祖华,李旺,闫文朝,王臣,赵战勤,程相朝,张春杰,王天奇,程安春,汪铭书. 畜牧兽医学报. 2013(02)
[4]表达鹅α干扰素基因重组禽痘病毒的构建及表达产物抑制鹅细小病毒活性的初步研究[J]. 张颖,高旭,陈海迪,鲁承. 中国预防兽医学报. 2012(12)
[5]猪流行性腹泻病毒重组腺病毒疫苗的构建及小鼠免疫试验[J]. 焦茂兴,吴锋,刘德辉,黄毓茂. 中国畜牧兽医. 2012(02)
[6]鹅细小病毒CHv强毒株VP3基因克隆及遗传进化[J]. 丁轲,程安春,张智信,汪铭书,余祖华,程相朝. 河南科技大学学报(自然科学版). 2011(06)
[7]霍尔多巴吉鹅源小鹅瘟病毒VP3基因的克隆及序列分析[J]. 董浩,段小波,单晓枫,胡桂学. 中国兽医杂志. 2011(10)
[8]鹅细小病毒不同毒株VP13基因的克隆与序列分析[J]. 韦艳梅,曹宗喜,廖明,张桂红,郑煦灿,单芬,罗开健. 动物医学进展. 2010(08)
[9]鹅细小病毒延边株VP3基因真核表达质粒构建[J]. 杜秋明,鲁承,王暖成. 江苏农业科学. 2010(03)
[10]靶向新城疫病毒NP基因的shRNA重组腺病毒表达载体的构建及鉴定[J]. 杨帆,岳华,侯巍,汤承. 中国预防兽医学报. 2010(01)
硕士论文
[1]鹅细小病毒病油乳剂灭活疫苗的研制[D]. 李琳.吉林大学 2008
本文编号：3708035
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