Marc-145细胞周期同步化及PRRSV细胞受体表达与病毒感染的关系

发布时间：2022-12-09 23:02

　　猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的高度接触性传染病，是危害养猪业的主要传染病之一。该病于1987年首先在美国爆发，而后在全球范围内迅速蔓延开来，该病毒于1996年首次在中国大陆分离到，给我国养猪业造成了巨大的经济损失。 PRRSV感染宿主细胞首先通过与细胞膜表面上的特异性受体结合，利用细胞的内吞作用而感染细胞。至今，已经报道的与PRRSV感染相关的细胞受体有唾液酸粘附素（Sialoadhesin, Sn）、硫酸乙酰肝素（Heparin sulphate，HS）、波形蛋白（Vimentin）、清道夫受体（CD163）。本实验室利用针对PRRSV GP5蛋白的单克隆抗独特型抗体（Mab2-5G2），在PRRSV易感细胞上发现并证明了非肌肉肌球蛋白重链ⅡA（Non-musclemyosin heavy chainⅡA，NMHC-ⅡA）为PRRSV的细胞受体蛋白。 一个完整的细胞周期是指细胞从上一次有丝分裂结束到下一次有丝分裂完成的过程。在这一完整的... 

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中文摘要
Abstract
1 引言
    1.1 细胞周期
    1.2 细胞周期调控
        1.2.1 细胞周期检测点
        1.2.2 细胞周期的调控蛋白
        1.2.3 细胞周期调控蛋白的降解
    1.3 细胞周期同步化
    1.4 猪繁殖与呼吸综合征概述
    1.5 PRRSV 生物学特征
    1.6 PRRSV 基因组结构
        1.6.1 非结构蛋白
        1.6.2 结构蛋白
    1.7 PRRSV 免疫学研究进展
        1.7.1 体液免疫
        1.7.2 细胞免疫
    1.8 PRRSV 受体的研究进展
        1.8.1 硫酸乙酰肝素
        1.8.2 唾液酸粘附素
        1.8.3 CD163
        1.8.4 波形蛋白
        1.8.5 非肌肉肌球蛋白Ⅱ型重链 A
    1.9 病毒感染与细胞周期
        1.9.1 病毒感染对细胞 G_1/S 检查点的调控
        1.9.2 病毒感染对细胞 G_2/M 期休眠的调控
    1.10 研究目的及意义
2 材料与方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 细胞、毒株与抗体
        2.1.2 实验动物
        2.1.3 主要试剂与药品
        2.1.4 主要试剂配制
        2.1.5 主要设备及仪器
    2.2 方法
        2.2.1 Marc-145 细胞的传代培养及 PRRSV 增殖
            2.2.1.1 Marc-145 细胞的培养及传代
            2.2.1.2 PRRSV 的增殖与病毒滴度测定
        2.2.2 单克隆抗独特型抗体 5G2 与 6D10 的制备与纯化
            2.2.2.1 腹水的制备
            2.2.2.2 单克隆抗体的纯化
        2.2.3 Marc-145 细胞周期同步化方法的建立
            2.2.3.1 Marc-145 细胞 G_0/G_1期细胞周期同步化方法的建立
            2.2.3.2 Marc-145 细胞 S 期细胞周期同步化方法的建立
            2.2.3.3 Marc-145 细胞 G_2/M 期细胞周期同步化方法的建立
            2.2.3.4 药物 Nocodazole 对 Marc-145 细胞分裂的影响
            2.2.3.5 流式细胞仪检测 Marc-145 细胞周期同步化效果
        2.2.4 统计学处理
        2.2.5 PRRSV 在 Marc-145 细胞不同周期内的易感性测定
            2.2.5.1 实时荧光定量（Real time PCR）测定
            2.2.5.2 间接免疫荧光（IFA）测定
            2.2.5.3 蛋白免疫印迹（Western blot）测定
            2.2.5.4 病毒上清 TCID_50测定
        2.2.6 Marc-145 细胞不同周期内 PRRSV 细胞受体表达量测定
            2.2.6.1 实时荧光定量（Real time PCR）测定细胞受体表达量
            2.2.6.2 蛋白免疫印迹（Western blot）测定细胞受体表达量
3 结果与分析
    3.1 单克隆抗独特型抗体 5G2 以及抗 PRRSV N 蛋白单克隆抗体 6D10 的制备与纯化
    3.2 Marc-145 细胞周期同步化方法的建立
        3.2.1 Marc-145 细胞 G_0/G_1期细胞周期同步化方法的建立
        3.2.2 Marc-145 细胞 S 期细胞周期同步化方法的建立
        3.2.3 Marc-145 细胞 G_2/M 期细胞周期同步化方法的建立
        3.2.4 药物 Nocodazole 对 Marc-145 细胞分裂的影响
    3.3 PRRSV 在 Marc-145 细胞不同周期内的易感性测定
        3.3.1 实时荧光定量（Real time PCR）测定 PRRSV 在 Marc-145 细胞不同周期内的吸附性差异
        3.3.2 间接免疫荧光（IFA）测定 PRRSV 在 Marc-145 细胞不同周期内的感染差异
        3.3.3 Western blot 测定 PRRSV 在 Marc-145 细胞不同周期内的感染差异
        3.3.4 TCID_50测定 PRRSV 感染不同周期 Marc-145 细胞后上清病毒含量的差异
    3.4 Marc-145 细胞不同周期内 PRRSV 细胞受体表达水平的检测
        3.4.1 Marc-145 细胞不同周期内 PRRSV 细胞受体基因水平的检测
        3.4.2 Marc-145 细胞不同周期内 PRRSV 细胞受体蛋白水平的检测
4 讨论
    4.1 Marc-145 细胞周期同步化方法的建立
    4.2 Marc-145 细胞不同周期对 PRRSV 感染细胞的影响
    4.3 Marc-145 细胞不同周期 PRRSV 细胞受体表达水平的差异
5 结论
参考文献
致谢
攻读学位期间发表论文情况


【参考文献】：
期刊论文
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[8]我国南方猪高热病的研究（Ⅰ）——大肠杆菌的分离、鉴定和致病性测定[J]. 宁宜宝,郑杰,张纯萍,宋立,刘惠文,王琴,丘惠深,丘伯根,赵启祖,沈青春,刘业兵,范学政,徐璐,江焕贤.  中国兽药杂志. 2006(12)
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本文编号：3715544