黑曲霉来源葡萄糖氧化酶的稳定性改良研究

发布时间：2022-12-11 07:39

　　葡萄糖氧化酶（Glucose oxidase,Gox）作为一种新型饲用酶制剂,在畜禽生产上通过改善肠道环境、预防肠道感染和腹泻,从而提高饲粮消化利用率,促进其生长。优良的饲用Gox应具有良好的热稳定性和酸稳定性。本研究以实验室前期获得的Gox酶突变体GoxM4为研究材料,利用计算机辅助设计进行分子改良研究,获得热稳定性和酸稳定性显著提高的突变体,并探究Gox的热稳定性和酸稳定性机理。采用计算机辅助的理性设计对GoxM4继续进行热稳定性改良研究。通过糖基化修饰、辅基FAD结合能优化、疏水作用力引入和折叠自由能优化等四种策略进行迭代突变,获得了累积5个氨基酸突变位点的突变体GoxM8（T31V/Q88R/S94A/T274F/Y278T）。GoxM8的热稳定性显著提高,在80°C下处理2 min后的剩余酶活由GoxM4的40%提高到了80%。基于酶恒定剩余酶活Amin与温度之间的负相关性计算其Tm值,GoxM8较GoxM4提高了9.5○C。Gox M8的催化效率（kcat/Km值）较GoxM4提高了6.8%,分别为28.3 mM-1s-1和26.5 m M-1s-1。利用分子动力学模拟技术... 

【文章页数】：71 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
abstract
主要符号对照表
第一章 绪论
    1.1 葡萄糖氧化酶概述
        1.1.1 葡萄糖氧化酶的来源
        1.1.2 葡萄糖氧化酶的基本性质
        1.1.3 葡萄糖氧化酶的结构特点及催化机理
        1.1.4 葡萄糖氧化酶的生产
        1.1.5 葡萄糖氧化酶的活性测定
        1.1.6 葡萄糖氧化酶的应用前景
    1.2 葡萄糖氧化酶的分子改良研究进展
    1.3 蛋白质稳定性及其分子改良
        1.3.1 非理性设计策略
        1.3.2 理性设计策略
    1.4 研究内容与目的
第二章 葡萄糖氧化酶GoxM4的热稳定性改良研究
    2.1 实验材料和仪器
        2.1.1 菌株和质粒
        2.1.2 引物合成和测序
        2.1.3 生化试剂、试剂盒和工具酶
        2.1.4 实验培养基及试剂配制
        2.1.5 实验仪器
    2.2 实验方法
        2.2.1 定点突变实验
        2.2.2 Gox各突变体的异源表达
        2.2.3 GoxM4及其突变体酶学性质测定
        2.2.4 GoxM4及其突变体的分子动力学模拟
    2.3 实验结果
        2.3.1 高通量平板筛选方法的建立
        2.3.2 GoxM4突变位点的设计
        2.3.3 GoxM4各突变体的筛选结果
        2.3.4 GoxM4及其突变体在摇床水平的表达和纯化
        2.3.5 GoxM4及其突变体的热稳定参数的评估
        2.3.6 GoxM4及其突变体的分子动力学模拟
    2.4 讨论
    本章小结
第三章 葡萄糖氧化酶GoxM8的酸稳定性改良研究
    3.1 实验材料和仪器
        3.1.1 菌株和质粒
        3.1.2 引物合成和测序
        3.1.3 生化试剂、试剂盒和工具酶
        3.1.4 实验培养基及试剂配制
        3.1.5 实验仪器
    3.2 实验方法
        3.2.1 模拟GoxM8 在胃肠道环境中的p H稳定性和活性
        3.2.2 GoxM8及其突变体的定点突变实验
        3.2.3 GoxM8及其突变体的异源表达
        3.2.4 GoxM8及各突变体酶学性质测定
    3.3 实验结果
        3.3.1 GoxM8 在胃肠道环境中的pH稳定性和活性的模拟结果
        3.3.2 GoxM8突变体的设计结果
        3.3.3 GoxM8突变体筛选结果
        3.3.4 GoxM8突变体摇床水平的表达和纯化结果
        3.3.5 GoxM8突变体的酶学性质鉴定
        3.3.6 GoxM8 突变体的pKa的计算结果
        3.3.7 GoxM8突变体的结构分析
    3.4 讨论
    本章小结
第四章 全文总结
参考文献
致谢
作者简历


【参考文献】：
期刊论文
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[4]葡萄糖氧化酶简介及其应用[J]. 康辉,李红飞,郝晓霞.  农业工程技术(农产品加工业). 2008(01)
[5]瑞氏木霉表达黑曲霉葡萄糖氧化酶[J]. 母敬郁,王峤,杨纯中,王恩思,王清,黄跃.  生物工程学报. 2006(01)
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本文编号：3718395