沙门氏菌鞭毛蛋白B亚单位对不同IBDV免疫原免疫效果的影响

发布时间：2022-12-18 10:58

　　沙门氏菌鞭毛蛋白是构成菌体鞭毛的单体蛋白,它不仅是细菌运动和黏附的重要组成原件,也是天然Toll样受体5 （Toll-like receptor, TLR）的激动剂,能够与TLR5结合激活MyD88信号途径,引起IL-8等细胞因子分泌增多,增强免疫细胞分化增殖等效应。虽然其本身具有沙门氏菌H抗原表位区域,却不影响其佐剂作用的发挥,甚至可作为自身佐剂增强鞭毛的抗原性,因此,自1998年其佐剂作用被发现以来,一直是疫苗免疫增强剂的研究热点,多项研究显示鞭毛蛋白能够增强原核和真核表达蛋白抗原的抗原性,通过对天然免疫因子的调节增强特异性免疫应答。干酪乳杆菌是安全级微生物（generally regarded as safe,GRAS）的益生菌,因其菌体成分和分泌物能够明显促进黏膜和体液免疫,亦是疫苗佐剂候选者。本研究利用重组鞭毛蛋白的免疫增强作用,通过以传染性法氏囊病毒（IBDV）为抗原模型,探讨了鞭毛蛋白对不同形式疫苗的免疫增强作用,结合干酪乳杆菌外源蛋白表达系统无毒素残留、菌体及分泌成分具有益生作用的优势,以期获得纯化步骤简单、易于生产的重组鞭毛蛋白作为疫苗免疫佐剂的候选者。利用PCR方法... 

【文章页数】：105 页

【学位级别】：博士

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英文摘要
1 前言
    1.1 沙门氏菌鞭毛蛋白的概况
        1.1.1 鞭毛蛋白的结构与功能
        1.1.2 鞭毛蛋白与天然免疫
        1.1.3 鞭毛蛋白与获得性免疫
    1.2 沙门氏菌鞭毛蛋白的佐剂作用
        1.2.1 鞭毛蛋白作为佐剂的研究进展
        1.2.2 鞭毛蛋白作为鸡疫苗佐剂的研究
    1.3 乳酸菌表达重组蛋白的优势
        1.3.1 乳酸菌作为疫苗佐剂的潜能
        1.3.2 乳酸菌作为活菌载体表达外源蛋白的研究
        1.3.3 禽为模型的乳酸菌相关研究
    1.4 IBDV疫苗的研究与应用
    1.5 本研究的目的与意义
2 材料与方法
    2.1 试验材料
        2.1.1 病毒、细胞和抗体
        2.1.2 实验动物
        2.1.3 质粒和菌株
        2.1.4 酶类及主要试剂
        2.1.5 引物
        2.1.6 主要仪器设备
    2.2 试验方法
        2.2.1 FIiB、FIiBc和IBDV VP2基因片段的克隆
        2.2.2 FliB、FliBc、VP2和FliBc-VP2基因E.coli表达载体的构建
        2.2.3 FliB、FliBc、VP2和FliBc-VP2在E.coli中表达和鉴定
        2.2.4 乳酸菌表达载体pPG-2-FliB、pPG-2-FliBc和pPG-2-FliBc-VP2的构建
        2.2.5 目的蛋白在干酪乳杆菌L.393中的诱导表达及鉴定
        2.2.6 乳酸菌表达的重组蛋白体外活性检测
        2.2.7 FliBc、VP2和FliBc-VP2重组蛋白的纯化和免疫
        2.2.8 pPG-2-FliB/L.casei393和pPG-2-FliBc/L.casei393培养上清的处理并和IBDV弱毒疫苗配合的免疫
        2.2.9 乳酸菌活载体疫苗的制备和免疫
        2.2.10 疫苗免疫效果的评估
3 实验结果
    3.1 IBDV-VP2、FliB和FliBc基因的克隆
        3.1.1 FliB和FliBc基因的克隆
        3.1.2 IBDV-VP2基因的克隆
    3.2 FliBc、VP2和FliBc-VP2基因E.coli表达载体的构建
        3.2.1 Ppro-HTa-FliB和Ppro-HTa-FliBc的构建
        3.2.2 重组载体Ppro-HTa-VP2的构建
        3.2.3 重组载体Ppro-HTa-FliBc-VP2的构建
    3.3 重组E.coli的诱导表达和鉴定
        3.3.1 鞭毛蛋白Fli的多克隆抗体的制备
        3.3.2 E.coli表达重组蛋白FliB和FliBc的表达鉴定
        3.3.3 Ppro-HTa-VP2/BL21的诱导表达和鉴定
        3.3.4 Ppro-HTa-FliC-VP2/BL21的诱导表达和鉴定
    3.4 重组乳酸菌载体的构建与鉴定
        3.4.1 重组载体pPG-2-FliB的构建及鉴定
        3.4.2 重组载体pPG-2-FliBc的构建及鉴定
        3.4.3 重组载体pPG-2-FliB-VP2的构建及鉴定
    3.5 FliB、FliBc和FliBc-VP2基因的乳酸菌表达及鉴定
        3.5.1 pPG-2-FliB/L.casei393、pPG-2-FliBc/L.casei393的诱导表达
        3.5.2 pPG-2-FliBc-VP2/L.casei393的诱导表达
    3.6 乳酸菌表达的重组蛋白FliB和FliBc体外活性检测
        3.6.1 重组乳酸菌表达蛋白的处理和检测
        3.6.2 对Caco-2细胞表达TLR-5和IL-8水平的影响
    3.7 FliBc对VP2亚单位疫苗佐剂活性的评估
        3.7.1 亚单位疫苗重组疫苗的纯化
        3.7.2 免疫SPF鸡血清中特异性IgY的测定
        3.7.3 特异性脾淋巴细胞增殖试验
        3.7.4 血清中和抗体效价
        3.7.5 攻毒保护性试验
    3.8 FliBc对IBDV弱毒疫苗佐剂活性的评估
        3.8.1 免疫SPF鸡血清中特异性IgY的测定
        3.8.2 特异性脾淋巴细胞增殖试验
        3.8.3 中和抗体水平
        3.8.4 攻毒保护试验
    3.9 FliBc对IBDV活载体疫苗佐剂活性的评估
        3.9.1 pPG2-VP2/L.casei393和pPG2-FliBc-VP2/L.casei393免疫SPF鸡血清特异性IgY的测定
        3.9.2 特异性脾淋巴细胞增殖活性
        3.9.3 液、气管灌洗液和肠粘液中分泌型IgA的测定
        3.9.4 中和抗体水平检测
        3.9.5 攻毒保护试验
4 讨论
    4.1 重组目的蛋白表达条件的优化选择
    4.2 鞭毛蛋白佐剂活性区域的选择
    4.3 IBDV作为抗原模型的选择
    4.4 鞭毛蛋白作为免疫佐剂对亚单位疫苗的免疫增强效应
    4.5 鞭毛蛋白对弱毒疫苗的免疫增强作用
    4.6 鞭毛蛋白作为乳酸菌疫苗的分子佐剂的免疫增强作用
    4.7 鞭毛蛋白应用的潜在价值
5 结论
致谢
参考文献
附录
攻读博士学位期间发表的学术论文


【参考文献】：
期刊论文
[1]细菌鞭毛的致病性及其免疫学应用的研究进展[J]. 郭志燕,周明旭,段强德,朱国强.  微生物学报. 2014(03)
[2]近期引起免疫失败的传染性腔上囊病病毒VP2基因的分子特征[J]. 王永山,欧阳伟,潘群兴,范红结,张海彬,王忠灿,唐雨德,谭维国.  中国兽医科学. 2008(12)
[3]传染性法氏囊病病毒检测系统的建立[J]. 王忠灿,王永山,唐雨德,谭维国,施正良,欧阳伟.  中国兽医学报. 2008(09)
[4]传染性法氏囊病病毒的生态学与流行病学研究[J]. 周宗安,王永山,邓小昭,刁振宇,高建,施正良,罗函禄,方元.  中国兽医学报. 1998(05)



本文编号：3721930