PDCoV内切核糖核酸酶nsp15的结构与功能研究
发布时间：2022-12-22 07:52
猪德尔塔冠状病毒（Porcine deltacoronavirus,PDCoV）属于δ冠状病毒属。临床症状主要是引起新生仔猪产生严重的呕吐、腹泻和脱水,最终导致仔猪死亡。2014年,美国猪场遭受PDCoV大规模流行,经济损失严重。2016年,流行病学调查显示我国多个省份的规模化猪场呈PDCoV阳性。由于目前针对PDCoV开展的研究尚少,市场上暂无有效的药物和疫苗可用。因此,PDCoV对我国的养猪业具有潜在危害性,具有重要的研究价值。其中,PDCoV非结构蛋白15（non-structural protein,nsp15）属于尼多病毒目内切核糖核酸酶,能特异性切割双链或单链核苷酸尿嘧啶,参与病毒复制过程,是病毒重要的毒力蛋白。本研究首次发现、证实并阐释了PDCoV nsp15以二聚体发挥酶活的作用机制。提出了尼多病毒目内切核糖核酸酶的进化假说,也为PDCoV乃至冠状病毒的药物设计和疫苗研发提供了思路。主要包括以下四个方面:1.PDCoV nsp15以二聚体和单体形式存在通过大肠杆菌原核表达系统、镍离子金属螯合亲和层析（Ni-NTA）得到PDCoV nsp15（H234A）、严重急性呼吸综...
【文章页数】：72 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略语表(Abbreviation)
第一章 文献综述
1.1 猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)
1.1.1 PDCoV流行病学调查
1.1.2 PDCoV临床症状和病理特征
1.2 PDCoV分子生物学特征
1.2.1 PDCoV形态特征和基因组结构
1.3 尼多病毒概况
1.3.1 尼多病毒的入侵、复制和释放
1.3.2 尼多病毒的基因组进化
1.3.3 尼多病毒目内切核糖核酸酶
1.4 冠状病毒内切核糖核酸酶
1.4.1 冠状病毒内切核糖核酸酶生物学功能
1.4.2 冠状病毒内切核糖核酸酶聚集形态
1.5 蛋白质聚集形态分析
1.5.1 蛋白质的原核表达与纯化
1.5.2 分子排阻层析和分析超速离心
1.6 荧光共振能量转移
第二章 研究目的与意义
第三章 材料与方法
3.1 实验材料
3.1.1 基因来源
3.1.2 菌株及质粒
3.1.3 工具酶和主要试剂
3.1.4 蛋白表达试剂配制
3.1.5 核酸胶电泳缓冲液配制
3.1.6 蛋白纯化缓冲液配制
3.1.7 聚丙烯酰胺凝胶电泳缓冲液及试剂
3.1.8 实验仪器及设备
3.1.9 分子生物学分析软件
3.2 实验方法
3.2.1 目的基因扩增
3.2.1.1 nsp15 基因引物序列
3.2.1.2 PCR扩增条件
3.2.1.3 PCR产物胶回收
3.2.1.4 目的DNA片段与载体质粒重组反应
3.2.1.5 重组质粒转化至感受态细胞
3.2.1.6 菌液PCR鉴定
3.2.1.7 DH5α重组质粒小提
3.2.1.8 质粒转化表达菌株感受态细胞
3.2.1.9 阳转质粒表达菌株冻存
3.2.2 原核表达质粒构建
3.2.2.1 引物
3.2.2.2 PDCoV、SARS-CoV及 PEDV nsp15 基因PCR扩增
3.2.2.3 PCR产物CP回收
3.2.2.4 限制性内切酶酶切反应
3.2.2.5 酶切目的片段与酶切载体质粒连接反应
3.2.2.6 质粒和PCR产物的测定
3.2.3 蛋白表达与纯化
3.2.3.1 重组蛋白小量预表达实验
3.2.3.2 重组蛋白大量表达与纯化
3.2.3.3 SDS-PAGE检验纯化后蛋白
3.2.3.4 Ni-NTA层析柱再生
3.2.3.5 分子筛层析实验
3.2.3.6 分子排阻层析分子筛
3.2.4 分析型超高速离心实验
3.2.5 内切核糖核酸酶(NendoU)体外酶活测定
3.2.6 序列分析和结构模拟
第四章 结果与分析
4.1 PDCoV nsp15 蛋白表达和纯化
4.2 PDCoV nsp15 蛋白聚集形态分析
4.2.1 SARS-CoV和 PEDV nsp15 基因克隆
4.2.2 分子筛标准品分析
4.2.3 蛋白质分子排阻层析
4.2.4 蛋白质超速离心分析
4.3 PDCoV nsp15 二聚体形成原因分析
4.3.1 PDCoV nsp15 三维结构模拟
4.3.2 PDCoV nsp15 NTD突变体蛋白聚集形态分析
4.3.3 SARS-CoV nsp15 突变体蛋白聚集形态分析
4.3.4 SARS-CoV和 PDCoV nsp15 三维结构分析
4.4 内切核糖核酸酶(EndoU)体外酶活功能研究
4.4.1 PDCoV nsp15 突变体蛋白体外酶活分析
4.4.2 SARS-CoV nsp15 突变体蛋白体外酶活分析
4.5 NendoU和 XendoU功能结构域保守性分析
4.6 NendoU和 XendoU氨基酸序列同源性分析
第五章 讨论
第六章 结论
参考文献
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]2012年～2016年广东省猪丁型冠状病毒的流行病学调查及分析[J]. 宋亚兵,徐帅飞,苏丹萍,石坚,贺东生. 中国预防兽医学报. 2018(10)
[2]猪δ冠状病毒病原学特征及检测技术研究进展[J]. 庄金秋,梅建国,张颖,杨丽梅,李峰. 中国动物检疫. 2018(01)
[3]猪Delta冠状病毒的研究进展[J]. 易新健,刘准,张翠翠,陈申秒. 中国兽医学报. 2017(11)
[4]猪δ冠状病毒的研究进展[J]. 方谱县,方六荣,董楠,肖少波. 病毒学报. 2016(02)
硕士论文
[1]猪δ冠状病毒（PDCoV）的流行病学调查与致病性研究[D]. 麦凯杰.华南农业大学 2018
本文编号：3723771
【文章页数】：72 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略语表(Abbreviation)
第一章 文献综述
1.1 猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)
1.1.1 PDCoV流行病学调查
1.1.2 PDCoV临床症状和病理特征
1.2 PDCoV分子生物学特征
1.2.1 PDCoV形态特征和基因组结构
1.3 尼多病毒概况
1.3.1 尼多病毒的入侵、复制和释放
1.3.2 尼多病毒的基因组进化
1.3.3 尼多病毒目内切核糖核酸酶
1.4 冠状病毒内切核糖核酸酶
1.4.1 冠状病毒内切核糖核酸酶生物学功能
1.4.2 冠状病毒内切核糖核酸酶聚集形态
1.5 蛋白质聚集形态分析
1.5.1 蛋白质的原核表达与纯化
1.5.2 分子排阻层析和分析超速离心
1.6 荧光共振能量转移
第二章 研究目的与意义
第三章 材料与方法
3.1 实验材料
3.1.1 基因来源
3.1.2 菌株及质粒
3.1.3 工具酶和主要试剂
3.1.4 蛋白表达试剂配制
3.1.5 核酸胶电泳缓冲液配制
3.1.6 蛋白纯化缓冲液配制
3.1.7 聚丙烯酰胺凝胶电泳缓冲液及试剂
3.1.8 实验仪器及设备
3.1.9 分子生物学分析软件
3.2 实验方法
3.2.1 目的基因扩增
3.2.1.1 nsp15 基因引物序列
3.2.1.2 PCR扩增条件
3.2.1.3 PCR产物胶回收
3.2.1.4 目的DNA片段与载体质粒重组反应
3.2.1.5 重组质粒转化至感受态细胞
3.2.1.6 菌液PCR鉴定
3.2.1.7 DH5α重组质粒小提
3.2.1.8 质粒转化表达菌株感受态细胞
3.2.1.9 阳转质粒表达菌株冻存
3.2.2 原核表达质粒构建
3.2.2.1 引物
3.2.2.2 PDCoV、SARS-CoV及 PEDV nsp15 基因PCR扩增
3.2.2.3 PCR产物CP回收
3.2.2.4 限制性内切酶酶切反应
3.2.2.5 酶切目的片段与酶切载体质粒连接反应
3.2.2.6 质粒和PCR产物的测定
3.2.3 蛋白表达与纯化
3.2.3.1 重组蛋白小量预表达实验
3.2.3.2 重组蛋白大量表达与纯化
3.2.3.3 SDS-PAGE检验纯化后蛋白
3.2.3.4 Ni-NTA层析柱再生
3.2.3.5 分子筛层析实验
3.2.3.6 分子排阻层析分子筛
3.2.4 分析型超高速离心实验
3.2.5 内切核糖核酸酶(NendoU)体外酶活测定
3.2.6 序列分析和结构模拟
第四章 结果与分析
4.1 PDCoV nsp15 蛋白表达和纯化
4.2 PDCoV nsp15 蛋白聚集形态分析
4.2.1 SARS-CoV和 PEDV nsp15 基因克隆
4.2.2 分子筛标准品分析
4.2.3 蛋白质分子排阻层析
4.2.4 蛋白质超速离心分析
4.3 PDCoV nsp15 二聚体形成原因分析
4.3.1 PDCoV nsp15 三维结构模拟
4.3.2 PDCoV nsp15 NTD突变体蛋白聚集形态分析
4.3.3 SARS-CoV nsp15 突变体蛋白聚集形态分析
4.3.4 SARS-CoV和 PDCoV nsp15 三维结构分析
4.4 内切核糖核酸酶(EndoU)体外酶活功能研究
4.4.1 PDCoV nsp15 突变体蛋白体外酶活分析
4.4.2 SARS-CoV nsp15 突变体蛋白体外酶活分析
4.5 NendoU和 XendoU功能结构域保守性分析
4.6 NendoU和 XendoU氨基酸序列同源性分析
第五章 讨论
第六章 结论
参考文献
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]2012年～2016年广东省猪丁型冠状病毒的流行病学调查及分析[J]. 宋亚兵,徐帅飞,苏丹萍,石坚,贺东生. 中国预防兽医学报. 2018(10)
[2]猪δ冠状病毒病原学特征及检测技术研究进展[J]. 庄金秋,梅建国,张颖,杨丽梅,李峰. 中国动物检疫. 2018(01)
[3]猪Delta冠状病毒的研究进展[J]. 易新健,刘准,张翠翠,陈申秒. 中国兽医学报. 2017(11)
[4]猪δ冠状病毒的研究进展[J]. 方谱县,方六荣,董楠,肖少波. 病毒学报. 2016(02)
硕士论文
[1]猪δ冠状病毒（PDCoV）的流行病学调查与致病性研究[D]. 麦凯杰.华南农业大学 2018
本文编号：3723771
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