利用CRISPR-Cas9技术和Cre/loxP系统构建猪伪狂犬病病毒gE基因缺失疫苗株

发布时间：2023-01-03 10:06

　　通过对4株伪狂犬病病毒（PRV）流行株进行比较,选择免疫原性最高的HNQYY2012为亲本株,利用CRISPR-Cas9技术和Cre/loxP系统构建带有LoxP位点的HNQYY2012ΔgE/EGFP⁺,然后利用环化重组酶（Cre）去除增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因,构建PRV gE基因缺失株HNQYY2012ΔgE。PCR鉴定和测序结果表明,PRV gE基因缺失株构建成功;一步生长曲线表明,HNQYY2012ΔgE增殖速度慢于亲本株,但最高滴度与亲本株相近;HNQYY2012ΔgE和亲本株对小鼠的半数致死量分别为10^3.8 TCID₅₀和10^2.5 TCID₅₀,表明gE基因缺失株毒力降低。制备的灭活疫苗免疫小鼠能完全抵御5LD₅₀和10LD₅₀强毒攻毒。本文利用CRISPR-Cas9技术和Cre/loxP系统成功构建PRV gE基因缺失株HNQYY2012ΔgE,为猪伪狂犬病灭活疫苗的研制提供了参考。 

【文章页数】：6 页

【文章目录】：
1 材料与方法
    1.1 主要试剂
    1.2 病毒和细胞
    1.3 质粒
    1.4 实验动物
    1.5 方法
        1.5.1 引物设计
        1.5.2 PRV亲本株筛选
        1.5.3 病毒基因组提取
        1.5.4 转移载体的构建
        1.5.5 HNQYY2012ΔgE/EGFP+的获得和纯化
        1.5.6 HNQYY2012ΔgE株的获得与纯化
        1.5.7 HNQYY2012ΔgE株的PCR鉴定
        1.5.8 HNQYY2012株亲本株与ΔgE株一步生长曲线
        1.5.9 HNQYY2012ΔgE株LD50测定
        1.5.10 猪伪狂犬病灭活疫苗(HNQYY2012ΔgE株)的制备和免疫效力试验
    1.6 统计与分析
2 结果与分析
    2.1 PRV亲本株筛选
    2.2 转移载体的构建
    2.3 重组病毒HNQYY2012ΔgE的获得与纯化
    2.4 HNQYY2012ΔgE和亲本毒一步生长曲线的测定
    2.5 HNQYY2012ΔgE和亲本毒LD50测定
    2.6 灭活疫苗(HNQYY201ΔgE株)的免疫效力试验
3 讨论


【参考文献】：
期刊论文
[1]基于CRISPR/Cas9技术构建犬IRGM4、IRGM5和IRGM6基因敲除的MDCK细胞系[J]. 徐广军,曹世诺,郑君,张险峰,贾洪林,郑永辉.  中国预防兽医学报. 2017(01)
[2]利用CRISPR/Cas9基因编辑技术抑制EV71复制[J]. 吴涛,朱小娟,樊欢,葛以跃,陈银,郭喜玲,赵康辰,史智扬,朱凤才,崔仑标.  中华微生物学和免疫学杂志. 2016 (11)
[3]应用Cre-loxP系统构建伪狂犬病病毒gE/TK双缺失株[J]. 梁苑燕,胡艳芬,张小荣,陈素娟,彭大新,刘秀梵.  畜牧兽医学报. 2012(11)

博士论文
[1]伪狂犬病病毒主要毒力基因功能的研究[D]. 阳爱国.四川农业大学 2005



本文编号：3727262