E种肠道病毒HY12毒株的标签病毒拯救及5’-UTR对病毒复制的影响

发布时间：2023-01-12 10:29

　　牛肠道病毒（Bovine enteroviruses,BEV）是小RNA病毒科肠道病毒属中的成员,是引起牛临床上以消化道和呼吸道症状为主要特征传染病的病原体。尽管BEV致病性通常较低,感染后引起动物出现温和的临床症状,但是易与其他病原体发生混合感染和继发感染,常常导致牛群出现较高的死亡率,严重危害养牛业的健康发展。BEV感染为国内新发疫病,目前有关该病的发病机理及防控等众多问题仍不清楚,缺乏研究。2012年本实验室从国内某地牛群暴发的临床上以咳嗽、呼吸困难、严重腹泻为主要特征、发病率和致死率分别高达50%的疫病中分离鉴定出国内首株E种肠道病毒HY12。对HY12病毒的研究发现,该病毒5’-UTR二级结构与其他肠道病毒明显不同,且病毒的TCID50可达108-9/0.1m L,进而为该病毒作为活载体递送与表达外源抗原提供了潜在可能性。因此,为了探究HY12病毒基因组的外源序列潜在插入位点,以便为HY12表达外源抗原重组病毒的研究提供有效的技术方法与基础。本研究利用分子生物学、反向遗传学、病毒学和突变PCR等技术与方法,通过构建HY12病毒基因组的感染性c DNA克隆并对病毒进行拯救与鉴定... 

【文章页数】：137 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
中文摘要
abstract
英文缩写词表
引言
第一篇 文献综述
    第1章 肠道病毒研究进展
        1.1 肠道病毒形态结构与理化性质
        1.2 肠道病毒及其分类
        1.3 肠道病毒基因结构及功能
            1.3.1 肠道病毒基因结构
            1.3.2 肠道病毒的 5'-UTR和 3'-UTR结构和功能
            1.3.3 肠道病毒编码的蛋白及其功能
        1.4 肠道病毒感染的流行情况
        1.5 肠道病毒感染与复制
        1.6 肠道病毒致病机制
    第2章 肠道病毒疫苗与载体疫苗
        2.1 肠道病毒疫苗研究概况
            2.1.1 EV-71 灭活疫苗
            2.1.2 EV-71 病毒样颗粒（VLP）
            2.1.3 EV-71 弱毒疫苗
            2.1.4 EV-71 亚单位疫苗和合成肽疫苗
            2.1.5 CV-A16灭活疫苗
            2.1.6 CV-A16病毒样粒子（VLP）
            2.1.7 EV-71/CV-A16二联疫苗
            2.1.8 联合疫苗
            2.1.9 脊髓灰质炎病毒（PV）灭活疫苗与弱毒疫苗
        2.2 肠道病毒载体疫苗的研究进展
    第3章 反向遗传学的研究
第二篇 研究内容
    第1章 HY12-VP2蛋白单克隆抗体制备及抗原表位鉴定
        1.1 材料
            1.1.1 细胞、病毒、载体、试剂、实验动物
            1.1.2 主要仪器
        1.2 方法
            1.2.1 HY12-VP2全长基因扩增与重组质粒构建
            1.2.2 HY12-VP2蛋白的表达、纯化及鉴定
            1.2.3 单抗制备
            1.2.4 HY12-VP2蛋白单抗表位鉴定
            1.2.5 亲本HY12-VP2亚细胞定位
            1.2.6 单抗表位的保守性分析
            1.2.7 单抗与不同BEV毒株相对应的表位区域交叉反应性分析
        1.3 结果
            1.3.1 重组VP2蛋白（GST-VP2）的表达
            1.3.2 抗VP2单克隆抗体的产生及特性
            1.3.3 单克隆抗体表位初步鉴定
            1.3.4 HY12-VP2蛋白的亚细胞定位
            1.3.5 单抗表位在不同BEV毒株中同源性分析
        1.4 讨论
        1.5 小结
    第2章 HA/Flag标签引入HY12病毒结构蛋白重组病毒的拯救及其生物学特性鉴定
        2.1 材料
            2.1.1 细胞、病毒、载体、试剂、实验动物
            2.1.2 主要仪器
        2.2 方法
            2.2.1 HY12毒株RNA的提取
            2.2.2 重组标签病毒全长c DNA克隆构建
            2.2.3 体外转染MDBK细胞
            2.2.4 IPMA鉴定拯救的重组标签病毒
            2.2.5 Western blot鉴定拯救的重组标签病毒
            2.2.6 激光共聚焦
            2.2.7 血清中和实验（SNA）
            2.2.8 电镜观察拯救的病毒粒子
            2.2.9 重组标签病毒一步生长曲线和形态学观察
            2.2.10 重组标签病毒遗传稳定性
            2.2.11 重组标签病毒与亲本病毒动物感染实验
            2.2.12 病毒核酸检测
            2.2.13 血清抗体检测
            2.2.14 统计分析
        2.3 结果
            2.3.1 重组标签病毒全长c DNA克隆构建及其鉴定
            2.3.2 重组标签病毒的拯救及其鉴定
            2.3.3 rHY12-VP1-HA病毒在ICR乳鼠体内的生物学特性
        2.4 讨论
        2.5 小结
    第3章 HA标签引入HY12病毒非结构蛋白重组病毒的拯救及其生物学特性鉴定
        3.1 材料
            3.1.1 细胞、病毒、载体、试剂、实验动物
            3.1.2 主要仪器
        3.2 方法
            3.2.1 重组标签病毒全长c DNA克隆构建
            3.2.2 体外转染MDBK细胞
            3.2.3 IPMA鉴定拯救的重组标签病毒
            3.2.4 Western blot鉴定拯救的重组标签病毒
            3.2.5 激光共聚焦
            3.2.6 电镜观察拯救的病毒粒子
            3.2.7 重组标签病毒生长的一步曲线和蚀斑形态学观察
            3.2.8 重组标签病毒遗传稳定性
            3.2.9 重组标签病毒在不同细胞系感染性
            3.2.10 重组标签病毒与亲本病毒动物感染实验
            3.2.11 血清抗体检测
            3.2.12 统计分析
        3.3 结果
            3.3.1 重组标签病毒全长c DNA克隆构建及其鉴定
            3.3.2 重组标签病毒的拯救及其鉴定
        3.4 讨论
        3.5 小结
    第4章 5'-UTR对HY12病毒复制的影响
        4.1 材料
            4.1.1 细胞、病毒、载体、试剂
            4.1.2 主要仪器
        4.2 方法
            4.2.1 突变体病毒全长c DNA克隆构建
            4.2.2 体外转染BHK-21 细胞
            4.2.3 突变体病毒不同时间点的TCID50测定
            4.2.4 突变体病毒Western blot鉴定
            4.2.5 突变体病毒蚀斑实验
            4.2.6 突变体病毒二级结构预测
            4.2.7 统计分析
        4.3 结果
            4.3.1 突变体病毒全长c DNA克隆构建
            4.3.2 突变体病毒不同时间点TCID50测定
            4.3.3 突变体病毒Western blot鉴定
            4.3.4 突变体病毒蚀斑形态
            4.3.5 突变体病毒二级结构预测
        4.4 讨论
        4.5 小结
结论
参考文献
导师简介
作者简介
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]双抗体夹心ELISA检测牛肠道病毒抗原方法的建立及流行病学调查[J]. 邢泽黎,王新平,朱利塞,鲁海冰,郭昌明,盖小春,王明月.  中国兽医学报. 2016(04)
[2]从吉林省肉牛场新发疫病分离出E种肠道病毒[J]. 邢泽黎,朱利塞,王新平,李苏靖,郭昌明,杨丽.  中国兽医学报. 2014(03)
[3]抗猪圆环病毒2型Cap蛋白中和性单克隆抗体的制备及鉴定[J]. 黄立平,刘长明,危艳武,张朝霞,陆月华,郭龙军.  中国预防兽医学报. 2009(02)
[4]Expression,purification and characterization of enterovirus-71 virus-like particles[J]. Yao-Chi Chung Jen-Huang Huang Chia-Wei Lai Heng-Chun Sheng Yu-Chen Hu,Department of Chemical Engineering,National Tsing Hua University,Hsinchu 300,Taiwan,China Shin-Ru Shih,School of Medical Technology,Chang Gung University,Taoyuan 333.Taiwan,China Mei-Shang Ho,Institute of Biomedical Sciences,Academia Sinica.Taipei 11529.Taiwan.China.  World Journal of Gastroenterology. 2006(06)

博士论文
[1]E种肠道病毒HY12准种与进化及VP1基因突变对病毒复制的影响[D]. 朱利塞.吉林大学 2017
[2]肠道病毒分子流行病学及肠道病毒71型感染致炎症反应机制研究[D]. 柳楠.中国人民解放军军事医学科学院 2014



本文编号：3729797