鸡白痢沙门菌噬菌体裂解酶LySP2在毕赤酵母中的表达及其初步应用

发布时间：2023-01-12 10:39

　　鸡白痢作为我国农业部要求重点监测的14种动物疫病之一,其病原菌对禽类的危害严重制约着养禽业的发展。鸡场鸡白痢的净化是根除本病的最佳方法。抗生素是防治鸡白痢的传统药物,但由于抗生素的长期广泛使用甚至是滥用导致耐药性日益严重,使得鸡白痢的防治和清除愈加困难。噬菌体及其裂解酶作为新型抗微生物制剂在改善食品、医疗安全等方面被广泛研究和应用,因此筛选鉴定高效鸡白痢沙门菌的噬菌体及其裂解酶,用于鸡白痢的防治和净化具有重要意义。本研究前期分离获得一株沙门菌噬菌体YSP2,针对裂解酶LySP2基因序列,设计并合成引物LySP2-ZF和LySP2-ZR,并在其5’端添加Xho I酶切位点和编码序列AAAAGA,在其3’端插入限制性内切酶Xba I的酶切位点。利用Xho I和Xba I分别双酶切LySP2与载体pPICZ-αA,将目的片段连接后构建重组质粒pPICZ-LySP2。经Sca I单酶切线性化后,电转化至毕赤酵母X33中,通过PCR鉴定、序列分析及Zeocin⁺抗性筛选获得了能够高效表达裂解酶LySP2的阳性菌株X33-pPICZ-LySP2。通过摇瓶发酵,分别对温度、时间... 

【文章页数】：70 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
中文摘要
abstract
前言
第一篇 文献综述
    第一章 鸡白痢沙门菌研究概况
        1.1 鸡白痢沙门菌病的流行现状
        1.2 鸡白痢沙门菌病发病机理及国内外耐药现状
        1.3 鸡白痢沙门菌病的防控趋势
    第二章 沙门菌特异性噬菌体及其裂解酶的研究进展
        2.1 噬菌体作为抑菌剂防治沙门菌
        2.2 噬菌体应用的流行及局限性
        2.3 裂解酶治疗的应用与发展
第二篇 研究内容
    第一章 裂解酶LYSP2的酵母真核表达系统的构建
        1 材料
            1.1 主要仪器
            1.2 菌株及质粒
            1.3 试剂
            1.4 试剂配制
            1.5 引物设计与合成
        2 方法
            2.1 鸡白痢沙门菌的培养
            2.2 沙门菌噬菌体YSP2的培养
            2.3 沙门菌噬菌体YSP2基因组的提取
            2.4 裂解酶LySP2基因的PCR扩增
            2.5 表达载体pPICZ-LySP2的构建与鉴定
            2.6 重组毕赤酵母菌株X33-pPICZ-LySP2的构建
            2.7 重组毕赤酵母菌X33-pPICZ-LySP2的诱导发酵及条件优化
            2.8 发酵上清液总蛋白浓度测定
            2.9 发酵产物的电泳检测
        3 结果
            3.1 噬菌体YSP2全基因组提取结果
            3.2 重组质粒pPICZαA-LySP2的鉴定结果
            3.3 重组质粒pPICZα-LySP2序列测定结果
            3.4 重组酵母菌株X33-pPICZ-LySP2的构建结果
            3.5 重组酵母菌株X33-pPICZ-LySP2的发酵产酶结果
            3.6 重组毕赤酵母菌X33-pPICZ-LySP2产酶条件的优化结果
            3.7 重组菌株X33-pPICZ-LySP2的诱导产物SDS-PAGE分析结果
            3.8 发酵产物的活性鉴定
            3.9 发酵上清蛋白总浓度测定
        4 讨论
            4.1 噬菌体YSP2及其裂解酶LySP2
            4.2 裂解酶LySP2的表达及活性
        5 小结
    第二章 重组裂解酶体外抑菌活性及雏鸡模型的治疗效果
        1 材料
            1.1 重组裂解酶、实验动物及菌株
            1.2 主要仪器
        2 方法
            2.1 平板打孔法检测抑菌活性
            2.2 重组酵母发酵产物最小抑菌浓度(MIC)测定
            2.3 重组裂解酶的pH值稳定性测试
            2.4 重组裂解酶的热稳定性测试
            2.5 重组裂解酶制剂的安全性测试
            2.6 鸡白痢沙门菌雏鸡感染模型的建立
            2.7 重组裂解酶在清除鸡白痢感染雏鸡模型中的疗效
            2.8 数据统计分析
        3 结果
            3.1 重组裂解酶抑菌活性鉴定结果
            3.2 重组裂解酶MIC测定结果
            3.3 重组裂解酶的热稳定性测试结果
            3.4 重组裂解酶的pH值稳定性测试结果
            3.5 重组裂解酶安全性检测结果
            3.6 重组裂解酶在鸡白痢感染雏鸡模型中的疗效
        4 讨论
            4.1 裂解酶活性
            4.2 裂解酶稳定性
            4.3 裂解酶的体内活性
        5 小结
结论
参考文献
导师简介
作者简介及在学期间所取得的科研成果
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]沙门菌减毒疫苗候选基因的研究进展[J]. 王耀楠,郭荣显,耿浩鹏,李求春,潘志明,耿士忠,焦新安.  中国家禽. 2017(09)
[2]禽沙门氏菌病的流行特点及防控措施[J]. 付春亮.  中国畜禽种业. 2016(05)
[3]李斯特菌噬菌体裂解酶的研究进展[J]. 刘珊娜,范志华,孙溪,付荣霞,吴海清.  天津农学院学报. 2016(01)
[4]朱砂七多糖对雏鸡十二指肠组织形态的影响[J]. 安乐,王娜,刘美琴,高红霞,牟素菁,郭浩杰,刘建新,张为民,卿素珠.  动物医学进展. 2015(12)
[5]响应面法优化重组毕赤酵母菌表达β-甘露聚糖酶的诱导条件[J]. 李慧玲,刘祖艳,赵敏.  安徽农业科学. 2014(11)
[6]动物性食品中土霉素、金霉素和四环素检测方法研究进展[J]. 杨琳.  中国动物检疫. 2012(08)
[7]双莲注射液对人工感染鸡白痢的治疗试验[J]. 封其善.  畜牧兽医科技信息. 2012(01)
[8]不同碳源下毕赤酵母GS115蛋白组学分析[J]. 田小梅,任建洪,房聪.  中国生物工程杂志. 2012(01)
[9]种鸡场沙门氏菌检测及净化措施[J]. 吴玙彤.  清远职业技术学院学报. 2011(03)
[10]山西省汾阳市鸡白痢的血清学调查[J]. 费强.  家禽科学. 2011(06)

硕士论文
[1]鸡白痢沙门菌噬菌体的分离鉴定及其初步应用[D]. 袁玉玉.吉林大学 2016
[2]细菌果胶裂解酶基因在毕赤酵母中的高效表达及酶学性质分析[D]. 刘晓肖.华南理工大学 2015
[3]鸡白痢沙门氏菌菌影（Ghost）疫苗的制备及其免疫效力评价[D]. 田秋丰.黑龙江八一农垦大学 2014
[4]大肠杆菌O157 Stx噬菌体裂解酶的原核表达及活性研究[D]. 杨曦.上海交通大学 2012
[5]莱州市鸡源致病性大肠杆菌流行病学调查与耐药性分析[D]. 原丽丽.山东农业大学 2007



本文编号：3729810