抗猪腹泻卵黄抗体添加剂的初步研究
发布时间：2023-01-29 08:37
卵黄抗体不仅可以对特定的病原起到很好的防控效果,同时由于卵黄抗体自身含有丰富的营养物质可以作为饲料添加剂提高动物的生长性能。因此,通过抗体蛋白饲料添加剂途径控制某些病毒性疾病不失为一种解决方法。猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea, PED）是由猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV）引起的一种以呕吐、腹泻和脱水为主要临床特征的高度接触性、高度致死性的传染病,是仔猪健康的主要威胁,而常规的疫苗免疫母猪对仔猪的保护效果不佳。因此,研发抗猪腹泻的卵黄抗体饲料添加剂便成为新的研究热点之一。本研究从患有猪流行性腹泻仔猪肠道组织中克隆了猪流行性腹泻病毒S基因中抗原指数较高且含有中和抗原域的499～638aa（COE基因）和636-789aa（PEDVS534基因）两段基因。利用基因重组技术将COE和PEDVS534两个中和抗原表位区克隆至载体pMD18-T上,酶切后连接pET-32a表达载体在大肠杆菌中表达。将原核表达的CC、PEDVS534两种重组蛋白和猪流行性腹泻全病毒灭活苗分别用白油佐剂乳化,分组免疫9月龄海...
【文章页数】：56 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
文献综述
1 卵黄抗体概述
1.1 IgY的结构
1.2 卵黄抗体的性质及特点
1.2.1 产量高
1.2.3 性能稳定
1.2.4 治疗效果好,安全性高
1.3 卵黄抗体的应用
1.3.1 卵黄抗体在诊断方面的应用
1.3.2 卵黄抗体在防治疾病方面的应用
2 卵黄抗体饲料添加剂的研究进展
3 猪流行性腹泻概述
3.1 PEDV的病原学特征
3.2 PED的流行病学特征
3.3 PED临床症状和病理变化
3.4 PEDV基因组结构
3.4.1 猪流行性腹泻病毒的基因组成
3.4.2 S蛋白的功能特性
3.4.3 M蛋白的功能特性
3.4.4 N蛋白的功能特性
3.5 猪流行性腹泻的诊断与防治
3.5.1 猪流行性腹泻的诊断
3.5.2 猪流行性腹泻的防治
4 不同形式免疫原制备抗PEDV卵黄抗体
4.1 PEDV全病毒免疫原制备卵黄抗体
4.2 重组蛋白抗原制备卵黄抗体
5 PEDV的中和抗原表位研究
6 病毒蛋白基因的原核表达与真核表达
6.1 原核表达
6.2 真核表达系统
6.3 毕赤酵母表达系统的应用
1 引言
2 材料与方法
2.1 试验材料
2.1.1 毒株、菌株、质粒、细胞及实验动物
2.1.2 PCR扩增引物设计
2.1.3 主要仪器
2.1.4 主要试剂
2.2 实验方法
2.2.1 猪流行性腹泻病毒PEDVS_(534)和PEDVS COE基因的克隆及原核表达
2.2.1.1 PEDVS_(534)和PEDVS COE基因的扩增
2.2.1.2 PEDVS_(534)和COE基因的克隆
2.2.1.3 PEDVS_(534)和COE基因的表达
2.2.1.4 目的蛋白的纯化
2.2.1.5 表达蛋白的免疫原性分析
2.2.2 PEDV COE基因的毕赤酵母表达
2.2.2.1 COE基因毕赤酵母表达载体的构建及转化
2.2.2.2 重组酵母菌株的鉴定
2.2.2.3 重组酵母菌株的诱导表达
2.2.2.4 重组蛋白的Western blot鉴定
2.2.2.5 重组蛋白免疫小鼠及血清中和试验的测定
2.2.3 卵黄抗体的制备
2.2.3.1 免疫原的制备
2.2.3.2 免疫程序
2.2.3.3 卵黄抗体的提取
2.2.3.4 卵黄抗体中和效价的测定
2.2.4 卵黄抗体的临床试验
3 结果与分析
3.1 PEDVS534和PEDVS COE基因的克隆及原核表达
3.1.1 PEDVS534和PEDVS COE基因的克隆
3.1.2 pMD18-T-PEDVS_(534)和pMD18-T-COE酶切鉴定
3.1.3 PEDVS_(534)和COE基因重组表达质粒的PCR及双酶切鉴定
3.1.4 PEDVS_(534)及COE重组蛋白的表达及Western blot
3.2 COE基因毕赤酵母表达
3.2.1 毕赤酵母表达重组质粒的构建
3.2.2 pPIC9K-COE重组酵母菌株的筛选与鉴定
3.2.3 COE重组酵母菌株分泌表达蛋白的SDS-PAGE及Western blot
3.2.4 病毒中和试验
3.3 卵黄抗体纯化效果
3.3.1 卵黄抗体的纯化效果
3.3.2 卵黄抗体的Western blot
3.4 卵黄抗体的效价检测
3.4.1 卵黄抗体的效价测定
3.4.2 卵黄抗体的临床试验
3.4.2.1 发病猪病料临床检测
3.4.2.2 发病猪场临床试验
4 讨论
4.1 COE基因的毕赤酵母表达研究
4.2 不同免疫原制备的卵黄抗体中和效力比较
5 结论
参考文献
致谢
作者简介
在读期间论文发表情况
【参考文献】：
期刊论文
[1]OSF1在毕赤酵母菌中的分泌表达及其生物活性[J]. 康东红,王燕,张洪美,冯潇雨,曹维,王萍. 生物工程学报. 2014(02)
[2]牛α干扰素在毕赤酵母中的高效分泌表达及活性鉴定[J]. 王延群,张璐,李玉明,汪志艳,金家民,刘永刚,王刚,王淑杰,姜成刚,涂亚斌,蔡雪辉. 中国预防兽医学报. 2013(10)
[3]活性蛋黄粉对断奶仔猪生长性能的影响[J]. 陈福华,隆雪明,易建希,唐芬兰,王清平. 当代畜牧. 2013(26)
[4]抗鸭坦布苏病毒病卵黄抗体的制备及应用试验[J]. 胡紫霞,王汉清,王立,殷冬冬,占松鹤,王楠楠,朱良强,王桂军. 中国动物检疫. 2013(07)
[5]猪IL-18在酵母中表达及活性检测[J]. 曹素芳,祁画丽. 中国兽医杂志. 2013(06)
[6]猪肺炎支原体P97R1基因在毕赤酵母中的分泌表达及初步应用（英文）[J]. 刘茂军,祝永琴,冯志新,吴叙苏,邵国青. Agricultural Science ＆ Technology. 2013(05)
[7]鹅干扰素-α的毕赤酵母表达及其生物学活性分析[J]. 朱永梅,曹永生,李鑫,马波,张文龙,高明春,王君伟. 中国兽医科学. 2013(04)
[8]抗仔猪腹泻高免全蛋粉的制备及效果评价[J]. 黄红梅,吴健敏,刘文娟,谢彬,覃绍敏,袁书智,白安斌,孙建华. 中国兽医学报. 2012(11)
[9]猪流行性腹泻病毒S基因片段的克隆及原核表达[J]. 王树坤,郎洪武,李轶女,陈晓春,张志芳. 生物技术进展. 2012(04)
[10]抗猪传染性胃肠炎病毒与猪流行性腹泻病毒卵黄抗体制备及其临床应用研究[J]. 崔焕忠,姜海龙,张加力,张辉,秦贵信. 中国畜牧兽医. 2012(06)
博士论文
[1]抗奶牛乳腺炎特异性卵黄抗体的制备及活性研究[D]. 甄宇红.大连理工大学 2008
[2]猪流行性腹泻病毒S蛋白抗原表位鉴定及受体结合域的初步筛选[D]. 孙东波.中国农业科学院 2008
硕士论文
[1]仔猪病毒性腹泻流行病学调查及卵黄抗体在PEDV防治中的应用[D]. 杜季梅.河南农业大学 2013
[2]鸡白细胞介素-6在毕赤酵母中的表达及生物活性检测[D]. 赵娜.扬州大学 2013
[3]禽呼肠孤病毒σC蛋白在毕赤酵母中的表达及免疫保护性研究[D]. 徐延伟.中国农业科学院 2012
[4]白假丝酵母脂肪酶CaLIP10的毕赤酵母优化表达及酶的特性分析[D]. 侯淑琳.华南理工大学 2012
[5]山东省部分地区猪瘟流行病学调查及其E2基因的毕赤酵母表达[D]. 王启宇.南京农业大学 2012
[6]猪瘟病毒四种不同抗原卵黄抗体中和效力评价[D]. 江馗语.东北农业大学 2012
[7]猪流行性腹泻病毒S1蛋白亲和肽的筛选与鉴定[D]. 杨巍.东北农业大学 2011
[8]PEDV S与猪IL-18联合DNA疫苗免疫效果研究[D]. 斯琴高娃.东北农业大学 2011
[9]猪病毒性腹泻多重RT-PCR诊断方法的建立和应用及猪轮状病毒的分离[D]. 张坤.华中农业大学 2010
[10]牛病毒性腹泻病毒（BVDV）卵黄抗体制备及其对病毒中和活性研究[D]. 赵玉龙.石河子大学 2009
本文编号：3732675
【文章页数】：56 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
文献综述
1 卵黄抗体概述
1.1 IgY的结构
1.2 卵黄抗体的性质及特点
1.2.1 产量高
1.2.3 性能稳定
1.2.4 治疗效果好,安全性高
1.3 卵黄抗体的应用
1.3.1 卵黄抗体在诊断方面的应用
1.3.2 卵黄抗体在防治疾病方面的应用
2 卵黄抗体饲料添加剂的研究进展
3 猪流行性腹泻概述
3.1 PEDV的病原学特征
3.2 PED的流行病学特征
3.3 PED临床症状和病理变化
3.4 PEDV基因组结构
3.4.1 猪流行性腹泻病毒的基因组成
3.4.2 S蛋白的功能特性
3.4.3 M蛋白的功能特性
3.4.4 N蛋白的功能特性
3.5 猪流行性腹泻的诊断与防治
3.5.1 猪流行性腹泻的诊断
3.5.2 猪流行性腹泻的防治
4 不同形式免疫原制备抗PEDV卵黄抗体
4.1 PEDV全病毒免疫原制备卵黄抗体
4.2 重组蛋白抗原制备卵黄抗体
5 PEDV的中和抗原表位研究
6 病毒蛋白基因的原核表达与真核表达
6.1 原核表达
6.2 真核表达系统
6.3 毕赤酵母表达系统的应用
1 引言
2 材料与方法
2.1 试验材料
2.1.1 毒株、菌株、质粒、细胞及实验动物
2.1.2 PCR扩增引物设计
2.1.3 主要仪器
2.1.4 主要试剂
2.2 实验方法
2.2.1 猪流行性腹泻病毒PEDVS_(534)和PEDVS COE基因的克隆及原核表达
2.2.1.1 PEDVS_(534)和PEDVS COE基因的扩增
2.2.1.2 PEDVS_(534)和COE基因的克隆
2.2.1.3 PEDVS_(534)和COE基因的表达
2.2.1.4 目的蛋白的纯化
2.2.1.5 表达蛋白的免疫原性分析
2.2.2 PEDV COE基因的毕赤酵母表达
2.2.2.1 COE基因毕赤酵母表达载体的构建及转化
2.2.2.2 重组酵母菌株的鉴定
2.2.2.3 重组酵母菌株的诱导表达
2.2.2.4 重组蛋白的Western blot鉴定
2.2.2.5 重组蛋白免疫小鼠及血清中和试验的测定
2.2.3 卵黄抗体的制备
2.2.3.1 免疫原的制备
2.2.3.2 免疫程序
2.2.3.3 卵黄抗体的提取
2.2.3.4 卵黄抗体中和效价的测定
2.2.4 卵黄抗体的临床试验
3 结果与分析
3.1 PEDVS534和PEDVS COE基因的克隆及原核表达
3.1.1 PEDVS534和PEDVS COE基因的克隆
3.1.2 pMD18-T-PEDVS_(534)和pMD18-T-COE酶切鉴定
3.1.3 PEDVS_(534)和COE基因重组表达质粒的PCR及双酶切鉴定
3.1.4 PEDVS_(534)及COE重组蛋白的表达及Western blot
3.2 COE基因毕赤酵母表达
3.2.1 毕赤酵母表达重组质粒的构建
3.2.2 pPIC9K-COE重组酵母菌株的筛选与鉴定
3.2.3 COE重组酵母菌株分泌表达蛋白的SDS-PAGE及Western blot
3.2.4 病毒中和试验
3.3 卵黄抗体纯化效果
3.3.1 卵黄抗体的纯化效果
3.3.2 卵黄抗体的Western blot
3.4 卵黄抗体的效价检测
3.4.1 卵黄抗体的效价测定
3.4.2 卵黄抗体的临床试验
3.4.2.1 发病猪病料临床检测
3.4.2.2 发病猪场临床试验
4 讨论
4.1 COE基因的毕赤酵母表达研究
4.2 不同免疫原制备的卵黄抗体中和效力比较
5 结论
参考文献
致谢
作者简介
在读期间论文发表情况
【参考文献】：
期刊论文
[1]OSF1在毕赤酵母菌中的分泌表达及其生物活性[J]. 康东红,王燕,张洪美,冯潇雨,曹维,王萍. 生物工程学报. 2014(02)
[2]牛α干扰素在毕赤酵母中的高效分泌表达及活性鉴定[J]. 王延群,张璐,李玉明,汪志艳,金家民,刘永刚,王刚,王淑杰,姜成刚,涂亚斌,蔡雪辉. 中国预防兽医学报. 2013(10)
[3]活性蛋黄粉对断奶仔猪生长性能的影响[J]. 陈福华,隆雪明,易建希,唐芬兰,王清平. 当代畜牧. 2013(26)
[4]抗鸭坦布苏病毒病卵黄抗体的制备及应用试验[J]. 胡紫霞,王汉清,王立,殷冬冬,占松鹤,王楠楠,朱良强,王桂军. 中国动物检疫. 2013(07)
[5]猪IL-18在酵母中表达及活性检测[J]. 曹素芳,祁画丽. 中国兽医杂志. 2013(06)
[6]猪肺炎支原体P97R1基因在毕赤酵母中的分泌表达及初步应用（英文）[J]. 刘茂军,祝永琴,冯志新,吴叙苏,邵国青. Agricultural Science ＆ Technology. 2013(05)
[7]鹅干扰素-α的毕赤酵母表达及其生物学活性分析[J]. 朱永梅,曹永生,李鑫,马波,张文龙,高明春,王君伟. 中国兽医科学. 2013(04)
[8]抗仔猪腹泻高免全蛋粉的制备及效果评价[J]. 黄红梅,吴健敏,刘文娟,谢彬,覃绍敏,袁书智,白安斌,孙建华. 中国兽医学报. 2012(11)
[9]猪流行性腹泻病毒S基因片段的克隆及原核表达[J]. 王树坤,郎洪武,李轶女,陈晓春,张志芳. 生物技术进展. 2012(04)
[10]抗猪传染性胃肠炎病毒与猪流行性腹泻病毒卵黄抗体制备及其临床应用研究[J]. 崔焕忠,姜海龙,张加力,张辉,秦贵信. 中国畜牧兽医. 2012(06)
博士论文
[1]抗奶牛乳腺炎特异性卵黄抗体的制备及活性研究[D]. 甄宇红.大连理工大学 2008
[2]猪流行性腹泻病毒S蛋白抗原表位鉴定及受体结合域的初步筛选[D]. 孙东波.中国农业科学院 2008
硕士论文
[1]仔猪病毒性腹泻流行病学调查及卵黄抗体在PEDV防治中的应用[D]. 杜季梅.河南农业大学 2013
[2]鸡白细胞介素-6在毕赤酵母中的表达及生物活性检测[D]. 赵娜.扬州大学 2013
[3]禽呼肠孤病毒σC蛋白在毕赤酵母中的表达及免疫保护性研究[D]. 徐延伟.中国农业科学院 2012
[4]白假丝酵母脂肪酶CaLIP10的毕赤酵母优化表达及酶的特性分析[D]. 侯淑琳.华南理工大学 2012
[5]山东省部分地区猪瘟流行病学调查及其E2基因的毕赤酵母表达[D]. 王启宇.南京农业大学 2012
[6]猪瘟病毒四种不同抗原卵黄抗体中和效力评价[D]. 江馗语.东北农业大学 2012
[7]猪流行性腹泻病毒S1蛋白亲和肽的筛选与鉴定[D]. 杨巍.东北农业大学 2011
[8]PEDV S与猪IL-18联合DNA疫苗免疫效果研究[D]. 斯琴高娃.东北农业大学 2011
[9]猪病毒性腹泻多重RT-PCR诊断方法的建立和应用及猪轮状病毒的分离[D]. 张坤.华中农业大学 2010
[10]牛病毒性腹泻病毒（BVDV）卵黄抗体制备及其对病毒中和活性研究[D]. 赵玉龙.石河子大学 2009
本文编号：3732675
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