山羊CRISPR/Cas9基因编辑系统优化的研究
发布时间：2023-02-03 17:55
近年来,CRISPR/Cas9技术被广泛应用于动物基因编辑领域,与传统基因编辑技术相比较,CRISPR/Cas9技术设计更简单、靶向效率更高、位点特异性更强,适用于进行大规模的动物基因编辑。但是,CRISPR/Cas9技术制备的基因编辑动物可能出现脱靶效应,通过CRISPR/Cas9体系显微注射的方式对牛羊等大型单胎动物进行编辑的效率远远低于在多胎动物上进行编辑的效率。为了进一步提高对山羊等大型单胎动物进行基因编辑的效率、减少甚至消除CRISPR/Cas9系统引起的脱靶效应,我们以靶向山羊FGF5基因的CRISPR/Cas9系统为例,对大动物基因编辑过程进行了优化。本研究主要通过对sgRNA的设计过程、胚胎注射CRISPR/Cas9系统的组分和基因打靶策略三个层面对大动物基因编辑的CRISPR/Cas9系统进行了优化,得到了可用于对山羊FGF5基因进行靶向敲除的高效率、无脱靶效应的sgRNA,获得了可用于山羊胚胎微注射体系的最适浓度,发现了多基因打靶策略可大大提高山羊基因打靶的效率和获得纯合阳性编辑个体的可能。试验过程和主要结果如下:1.sgRNA设计的优化。首先对目前已公布的、可设计...
【文章页数】：82 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
abstract
第一章 CRISPR/Cas9系统及基因编辑羊的研究进展
1.1 CRISPR/Cas9系统研究进展
1.1.1 CRISPR/Cas9系统的发展简史
1.1.2 CRISPR/Cas9系统的基因编辑类型
1.1.3 CRISPR/Cas9系统的应用
1.2 CRISPR/Cas9系统在羊上的研究
1.2.1 羊的相关功能基因的介绍
1.2.2 CRISPR/Cas9系统在羊上的应用
1.2.3 基因编辑羊存在的问题
1.3 研究目的和意义
1.3.1 降低基因编辑羊的脱靶效应
1.3.2 提高山羊的基因编辑效率和纯合率
第二章 山羊sgRNA设计的优化
2.1 方法
2.1.1 对比sgRNA设计软件
2.1.2 设计sgRNA
2.1.3 sgRNA的筛选
2.1.4 构建U6-sgRNA载体
2.1.5 细胞药物筛选浓度的确定
2.1.6 U6-sgRNA和Cas9载体的转染
2.1.7 检测编辑效率
2.1.8 检测sg8脱靶效应
2.1.9 单克隆测序
2.2 结果与分析
2.2.1 sgRNA设计
2.2.2 稻瘟菌素和嘌呤霉素筛选浓度
2.2.3 sgRNA编辑效率的检测
2.2.4 脱靶效应检测
2.3 讨论
2.4 小结
第三章 山羊CRISPR系统微注射组分的优化
3.1 方法
3.1.1 供试羊处理
3.1.2 T7-sgRNA质粒构建
3.1.3 Cas9mRNA体外转录
3.1.4 sgRNA体外转录
3.1.5 配制微注射溶液
3.1.6 胚胎回收及显微注射
3.1.7 提取基因组DNA
3.1.8 检测编辑效率
3.1.9 检测脱靶效应
3.1.10 检测编辑类型
3.2 结果与分析
3.2.1 胚胎回收及分组
3.2.2 鉴定Cas9mRNA和sgRNA
3.2.3 胚胎分裂率和编辑效率
3.2.4 编辑类型检测
3.2.5 脱靶效应检测
3.3 讨论
3.4 小结
第四章 基因编辑山羊打靶策略和效果的研究
4.1 方法
4.1.1 制备基因编辑羊
4.1.2 编辑效率检测
4.1.3 单克隆测序
4.2 结果与分析
4.2.1 羔羊存活数
4.2.2 编辑效率检测
4.2.3 编辑类型检测
4.3 讨论
4.4 小结
第五章 结论
5.1 研究结论
5.2 创新点
5.3 下一步研究内容
参考文献
附录
致谢
作者简介
【参考文献】：
期刊论文
[1]CRISPR/Cas9系统的脱靶效应[J]. 尹珅,贺桂芳,赖方秾,谢凤云,马俊宇. 生物技术通报. 2016(03)
[2]Identification of Sheep Ovary Genes Potentially Associated with Off-season Reproduction[J]. Hugh T.Blair,Runlin Z.Ma. 遗传学报. 2012(04)
本文编号：3734644
【文章页数】：82 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
abstract
第一章 CRISPR/Cas9系统及基因编辑羊的研究进展
1.1 CRISPR/Cas9系统研究进展
1.1.1 CRISPR/Cas9系统的发展简史
1.1.2 CRISPR/Cas9系统的基因编辑类型
1.1.3 CRISPR/Cas9系统的应用
1.2 CRISPR/Cas9系统在羊上的研究
1.2.1 羊的相关功能基因的介绍
1.2.2 CRISPR/Cas9系统在羊上的应用
1.2.3 基因编辑羊存在的问题
1.3 研究目的和意义
1.3.1 降低基因编辑羊的脱靶效应
1.3.2 提高山羊的基因编辑效率和纯合率
第二章 山羊sgRNA设计的优化
2.1 方法
2.1.1 对比sgRNA设计软件
2.1.2 设计sgRNA
2.1.3 sgRNA的筛选
2.1.4 构建U6-sgRNA载体
2.1.5 细胞药物筛选浓度的确定
2.1.6 U6-sgRNA和Cas9载体的转染
2.1.7 检测编辑效率
2.1.8 检测sg8脱靶效应
2.1.9 单克隆测序
2.2 结果与分析
2.2.1 sgRNA设计
2.2.2 稻瘟菌素和嘌呤霉素筛选浓度
2.2.3 sgRNA编辑效率的检测
2.2.4 脱靶效应检测
2.3 讨论
2.4 小结
第三章 山羊CRISPR系统微注射组分的优化
3.1 方法
3.1.1 供试羊处理
3.1.2 T7-sgRNA质粒构建
3.1.3 Cas9mRNA体外转录
3.1.4 sgRNA体外转录
3.1.5 配制微注射溶液
3.1.6 胚胎回收及显微注射
3.1.7 提取基因组DNA
3.1.8 检测编辑效率
3.1.9 检测脱靶效应
3.1.10 检测编辑类型
3.2 结果与分析
3.2.1 胚胎回收及分组
3.2.2 鉴定Cas9mRNA和sgRNA
3.2.3 胚胎分裂率和编辑效率
3.2.4 编辑类型检测
3.2.5 脱靶效应检测
3.3 讨论
3.4 小结
第四章 基因编辑山羊打靶策略和效果的研究
4.1 方法
4.1.1 制备基因编辑羊
4.1.2 编辑效率检测
4.1.3 单克隆测序
4.2 结果与分析
4.2.1 羔羊存活数
4.2.2 编辑效率检测
4.2.3 编辑类型检测
4.3 讨论
4.4 小结
第五章 结论
5.1 研究结论
5.2 创新点
5.3 下一步研究内容
参考文献
附录
致谢
作者简介
【参考文献】：
期刊论文
[1]CRISPR/Cas9系统的脱靶效应[J]. 尹珅,贺桂芳,赖方秾,谢凤云,马俊宇. 生物技术通报. 2016(03)
[2]Identification of Sheep Ovary Genes Potentially Associated with Off-season Reproduction[J]. Hugh T.Blair,Runlin Z.Ma. 遗传学报. 2012(04)
本文编号：3734644
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/dongwuyixue/3734644.html
