miRNA骨架内置siRNA干扰J亚群禽白血病病毒复制
发布时间：2023-02-05 10:57
J亚群禽白血病（subgroup J of avian leukosis virus）是由反转录病毒科的J亚群禽白血病病毒引起的以髓细胞瘤和其他细胞恶性肿瘤为特征的传染性肿瘤性疾病。J亚群禽白血病病毒（ALV-J）的基因排列顺序从5’端至3’端依次为LTR-leader-gag-pol-env-leader-LTR，主要含有gag、pol、env三个结构基因及结构基因两侧的长末端序列（long terminal repeats，LTR）。 近年来，虽然各检测技术有所提高，但因一些条件限制，该病对我国的危害依然很大。由于亚群间各毒株比较相近，但不同遗传特征的病毒引起的不同肿瘤的潜伏期不同，所以目前尚无有效防治J亚群禽白血病的方法；由于ALV-J的垂直传播性、先天感染的免疫耐受鸡是主要的传染源，目前也无可用的疫苗，所以应该另寻方法，靶向于病毒找寻攻克这一难题的方法。 RNA干扰（RNA interfrence，RNAi），是由2l nt～23nt的双链RNA（Double strandedRNA，dsRNA）引起的同源的内源性mRNA降解，从而导致基因表达沉默的现象，所以为了更...
【文章页数】：68 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
中英文缩写
中文摘要
Abstract
1 引言
1.1 禽白血病病毒研究现状
1.1.1 ALV 的分类
1.1.2 ALV-J 的发现
1.1.3 ALV-J 病毒结构特征
1.1.4 ALV-J 的流行病学研究现状
1.1.5 ALV-J 的致病性
1.1.6 ALV-J 的病理变化
1.1.7 ALV-J 的诊断
1.1.8 ALV-J 的防治
1.2 RNA 干扰的研究现状
1.2.1 RNA 干扰的发现
1.2.2 RNAi 的作用机制
1.2.3 siRNA 的制备
1.2.4 siRNA 与 miRNA
1.2.5 RNAi 的临床应用
1.2.6 RNAi 在禽病研究中的应用
2 材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 病毒、细胞和实验动物
2.1.2 实验试剂
2.1.3 试验地点
2.1.4 实验设备
2.2 实验方法及检测指标
2.2.1 siRNA 筛选及 miRNA 发卡结构设计
2.2.2 真核表达载体的构建
2.2.3 重组干扰表达质粒的转化与鉴定
2.2.3.1 感受态细胞的制备
2.2.3.2 重组干扰表达质粒的转化
2.2.3.3 去内毒素质粒的抽提
2.2.3.4 质粒的测序鉴定
2.2.4 间接免疫荧光法对 ALV-J 病毒滴度的测定
2.2.5 DF-1 细胞禽白血病病毒的接种
2.2.6 siRNA 重组干扰表达质粒的单独及联合转染
2.2.7 间接免疫荧光法检测 ALV 活病毒囊膜蛋白的表达水平
2.2.8 Real-time PCR 对 ALV-J 的 mRNA 表达水平的检测
2.2.8.1 细胞总 RNA 的提取
2.2.8.2 RNA 反转录为 cDNA
2.2.8.3 Real-time PCR
2.2.9 Western blot 检测病毒囊膜蛋白表达水平
2.2.9.1 细胞总蛋白的提取
2.2.9.2 细胞总蛋白 Western blot 检测病毒囊膜蛋白表达水平
2.2.10 实验动物病毒及重组表达干扰质粒的接种
2.2.11 临床症状观察
2.2.12 感染鸡排毒监测
2.2.13 血液学指标检测
2.2.14 大体剖检病变观察
2.2.15 组织病理学观察
3.结果与分析
3.1 重组干扰表达质粒测序结果
3.2 间接免疫荧光法对 ALV-J 病毒滴度的测定
3.3 重组干扰表达质粒转染效率的检测
3.4 间接免疫荧光法检测 ALV-J 囊膜蛋白的表达水平
3.5 Real-time PCR 对 ALV-J 的 mRNA 表达水平的检测
3.6 Western blot 检测 ALV-J 囊膜蛋白的表达水平
3.7 临床症状
3.8 感染鸡排毒监测
3.9 血液学指标检测
3.9.1 血清中抗体的检测
3.9.2 白细胞数量的检测
3.9.3 血涂片观察
3.10 大体剖检病变
3.11 组织病理学症状
3.12 统计学方法
4.讨论
5.结论
参考文献
研究生期间论文发表情况
致谢
本文编号：3734849
【文章页数】：68 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
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中文摘要
Abstract
1 引言
1.1 禽白血病病毒研究现状
1.1.1 ALV 的分类
1.1.2 ALV-J 的发现
1.1.3 ALV-J 病毒结构特征
1.1.4 ALV-J 的流行病学研究现状
1.1.5 ALV-J 的致病性
1.1.6 ALV-J 的病理变化
1.1.7 ALV-J 的诊断
1.1.8 ALV-J 的防治
1.2 RNA 干扰的研究现状
1.2.1 RNA 干扰的发现
1.2.2 RNAi 的作用机制
1.2.3 siRNA 的制备
1.2.4 siRNA 与 miRNA
1.2.5 RNAi 的临床应用
1.2.6 RNAi 在禽病研究中的应用
2 材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 病毒、细胞和实验动物
2.1.2 实验试剂
2.1.3 试验地点
2.1.4 实验设备
2.2 实验方法及检测指标
2.2.1 siRNA 筛选及 miRNA 发卡结构设计
2.2.2 真核表达载体的构建
2.2.3 重组干扰表达质粒的转化与鉴定
2.2.3.1 感受态细胞的制备
2.2.3.2 重组干扰表达质粒的转化
2.2.3.3 去内毒素质粒的抽提
2.2.3.4 质粒的测序鉴定
2.2.4 间接免疫荧光法对 ALV-J 病毒滴度的测定
2.2.5 DF-1 细胞禽白血病病毒的接种
2.2.6 siRNA 重组干扰表达质粒的单独及联合转染
2.2.7 间接免疫荧光法检测 ALV 活病毒囊膜蛋白的表达水平
2.2.8 Real-time PCR 对 ALV-J 的 mRNA 表达水平的检测
2.2.8.1 细胞总 RNA 的提取
2.2.8.2 RNA 反转录为 cDNA
2.2.8.3 Real-time PCR
2.2.9 Western blot 检测病毒囊膜蛋白表达水平
2.2.9.1 细胞总蛋白的提取
2.2.9.2 细胞总蛋白 Western blot 检测病毒囊膜蛋白表达水平
2.2.10 实验动物病毒及重组表达干扰质粒的接种
2.2.11 临床症状观察
2.2.12 感染鸡排毒监测
2.2.13 血液学指标检测
2.2.14 大体剖检病变观察
2.2.15 组织病理学观察
3.结果与分析
3.1 重组干扰表达质粒测序结果
3.2 间接免疫荧光法对 ALV-J 病毒滴度的测定
3.3 重组干扰表达质粒转染效率的检测
3.4 间接免疫荧光法检测 ALV-J 囊膜蛋白的表达水平
3.5 Real-time PCR 对 ALV-J 的 mRNA 表达水平的检测
3.6 Western blot 检测 ALV-J 囊膜蛋白的表达水平
3.7 临床症状
3.8 感染鸡排毒监测
3.9 血液学指标检测
3.9.1 血清中抗体的检测
3.9.2 白细胞数量的检测
3.9.3 血涂片观察
3.10 大体剖检病变
3.11 组织病理学症状
3.12 统计学方法
4.讨论
5.结论
参考文献
研究生期间论文发表情况
致谢
本文编号：3734849
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