EHEC O157:H7保护性抗原的筛选和鉴定
发布时间：2023-02-06 10:42
研究背景肠出血性大肠杆菌(enterohemorrhagic E.coli, EHEC) O157:H7是一种重要的人畜共患病原菌,抗生素治疗可能会加剧溶血性尿毒综合症(haemolutic uraemic syndrome, HUS)。所以发展疫苗是控制EHEC O157:H7在动物肠道定居繁殖和预防人感染及其并发症的最有效手段。 研究目的EHEC O157:H7的致病因子主要有粘附相关因子、毒素和溶血素等,这些组分以及它们的全分子或部分结构是目前最重要的保护性抗原的筛选目标。本研究拟用生物信息学的方法,以str.k12MG1655非致病性大肠杆菌为比对模板,筛选5株EHEC O157:H7菌株内保守性的定位外膜和胞外的差异编码序列,应用大肠杆菌原核表达技术制备筛选出的蛋白。分别应用细胞水平的黏附模型、动物水平的免疫与保护力效力试验等,筛选与鉴定了EHEC O157:H7有效保护性抗原,并探讨了免疫作用机制,为新型疫苗的研制提供了实践基础。 研究方法首先从NCBI网站GenBank上查到MG1655、EDL933、Sakai、EC4115、 TW14359和Xuzhou21等6个毒株...
【文章页数】：73 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
目录
前言
0.1. 研究背景
0.2. EHEC疫苗的研究进展
0.3. 反向疫苗学
0.4. 研究目的与意义
第一章 EHEC 0157：H7保护性抗原的筛选
1.1 方法
1.1.1 基因组序列和氨基酸序列查找
1.1.2 ORF的预测和差异分析
1.1.3 亚细胞定位
1.2 结果
1.2.1 大肠杆菌MG1655、EDL933、Sakai、EC4115、TW14359和Xuzhou21六株的基因及其编码序列
1.2.2 ORF的预测和差异分析
1.2.3 抗原的筛选
1.2.4 亚细胞定位
1.3 讨论
第二章 抗原基因的克隆、表达与纯化
2.1 材料
2.1.1 载体与菌株
2.1.2 试剂
2.1.3 主要仪器
2.2 方法
2.2.1 目的基因的扩增
2.2.2 目的基因的克隆、转化和酶切鉴定
2.2.3 重组表达质粒pET22b(+)-espA和pET22b(+)-espB的构建、转化与鉴定
2.2.4 重组表达型基因工程菌的构建
2.2.5 重组基因工程菌的诱导表达及检测
2.2.6 重组蛋白的大量表达、亲和层析纯化
2.2.7 Western Blotting鉴定重组蛋白
2.2.8 目的蛋白多抗血清的制备
2.3 结果
2.3.1 PCR目的基因的扩增和克隆
2.3.2 重组表达质粒pET22b(+)-目的基因的构建、转化与鉴定
2.3.3 基因重组菌的诱导表达及融合蛋白的鉴定
2.4 讨论
2.4.1 目标基因的扩增
2.4.2 工程菌蛋白的诱导表达
2.4.3 大肠杆菌表达条件的优化
2.4.4 重组融合蛋白纯化条件的优化
第三章 抗原蛋白在小鼠体内免疫保护性的初步检测
3.1 试验材料
3.1.1 菌株
3.1.2 试验动物
3.2 试验方法
3.2.1 目的蛋白的免疫原性分析
3.2.2 免疫小鼠的攻毒保护试验
3.2.3 小鼠的高剂量攻毒
3.2.4 ELISA分析蛋白免疫小鼠血清中抗体亚型
3.3 结果
3.3.1 目的蛋白的免疫原性分析
3.3.2 10MLD攻毒后小鼠的观察
3.3.3 50MLD和100MLD攻毒后小鼠的观察
3.3.4 Paa免疫组小鼠血清抗体亚型的测定
3.4. 讨论
第四章 新型蛋白Paa、Z0390、Z4191及Z1211在功能上的探索研究
4.1 材料
4.1.1 菌株,质粒及培养基
4.1.2 生化与分子生物写试剂
4.1.3 其他耗材及仪器
4.2 方法
4.2.1 Paa、Z0390以及Z4191小鼠血清抗EHEC 0157：H7黏附Hep-2细胞检测
4.2.2 Paa免疫组受试动物的排菌量监测
4.2.3 Z0390以及Z1211自转运功能的验证
4.3 结果
4.3.1 Paa、Z0390及Z4191细胞水平的黏附测定
4.3.2 Paa小鼠攻毒后的排菌量监测
4.3.3 Z0390和Z1211自转运功能的验证
4.4 讨论
第五章 全文总结
参考文献
英文缩略词表
致谢
个人简介
本文编号：3735849
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【学位级别】：硕士
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摘要
Abstract
目录
前言
0.1. 研究背景
0.2. EHEC疫苗的研究进展
0.3. 反向疫苗学
0.4. 研究目的与意义
第一章 EHEC 0157：H7保护性抗原的筛选
1.1 方法
1.1.1 基因组序列和氨基酸序列查找
1.1.2 ORF的预测和差异分析
1.1.3 亚细胞定位
1.2 结果
1.2.1 大肠杆菌MG1655、EDL933、Sakai、EC4115、TW14359和Xuzhou21六株的基因及其编码序列
1.2.2 ORF的预测和差异分析
1.2.3 抗原的筛选
1.2.4 亚细胞定位
1.3 讨论
第二章 抗原基因的克隆、表达与纯化
2.1 材料
2.1.1 载体与菌株
2.1.2 试剂
2.1.3 主要仪器
2.2 方法
2.2.1 目的基因的扩增
2.2.2 目的基因的克隆、转化和酶切鉴定
2.2.3 重组表达质粒pET22b(+)-espA和pET22b(+)-espB的构建、转化与鉴定
2.2.4 重组表达型基因工程菌的构建
2.2.5 重组基因工程菌的诱导表达及检测
2.2.6 重组蛋白的大量表达、亲和层析纯化
2.2.7 Western Blotting鉴定重组蛋白
2.2.8 目的蛋白多抗血清的制备
2.3 结果
2.3.1 PCR目的基因的扩增和克隆
2.3.2 重组表达质粒pET22b(+)-目的基因的构建、转化与鉴定
2.3.3 基因重组菌的诱导表达及融合蛋白的鉴定
2.4 讨论
2.4.1 目标基因的扩增
2.4.2 工程菌蛋白的诱导表达
2.4.3 大肠杆菌表达条件的优化
2.4.4 重组融合蛋白纯化条件的优化
第三章 抗原蛋白在小鼠体内免疫保护性的初步检测
3.1 试验材料
3.1.1 菌株
3.1.2 试验动物
3.2 试验方法
3.2.1 目的蛋白的免疫原性分析
3.2.2 免疫小鼠的攻毒保护试验
3.2.3 小鼠的高剂量攻毒
3.2.4 ELISA分析蛋白免疫小鼠血清中抗体亚型
3.3 结果
3.3.1 目的蛋白的免疫原性分析
3.3.2 10MLD攻毒后小鼠的观察
3.3.3 50MLD和100MLD攻毒后小鼠的观察
3.3.4 Paa免疫组小鼠血清抗体亚型的测定
3.4. 讨论
第四章 新型蛋白Paa、Z0390、Z4191及Z1211在功能上的探索研究
4.1 材料
4.1.1 菌株,质粒及培养基
4.1.2 生化与分子生物写试剂
4.1.3 其他耗材及仪器
4.2 方法
4.2.1 Paa、Z0390以及Z4191小鼠血清抗EHEC 0157：H7黏附Hep-2细胞检测
4.2.2 Paa免疫组受试动物的排菌量监测
4.2.3 Z0390以及Z1211自转运功能的验证
4.3 结果
4.3.1 Paa、Z0390及Z4191细胞水平的黏附测定
4.3.2 Paa小鼠攻毒后的排菌量监测
4.3.3 Z0390和Z1211自转运功能的验证
4.4 讨论
第五章 全文总结
参考文献
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致谢
个人简介
本文编号：3735849
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