鸡传染性支气管炎病毒间接N-ELISA试剂盒的研制及反转录环介导等温扩增（RT-LAMP）检测方法的建立
发布时间：2023-02-06 17:46
鸡传染性支气管炎(Avian Infectious Bronchitis,IB)是由鸡传染性支气管炎病毒(Infectious Bronchitis Virus,IBV)引起的鸡的一种急性、高度接触性传染病。IB可感染所有日龄的鸡并且还常常引起支原体混合感染以及大肠杆菌等继发感染从而增加鸡群的死亡率,给养鸡业生产带来巨大的损失。目前,该病呈世界性流行,是严重危害世界养禽业的重要传染病之一。IBV基因组容易发生变异导致其血清型众多,不同血清型之间交叉保护力弱,给本病防治带来很大的困难。因此探索快速、灵敏、特异的抗体检测和病原诊断方法已成为当前迫切需要解决的难题。当前IBV抗体血清学检测方法中,ELISA因具有快速、简便、准确、特异的特点被广泛采用并已被国际兽疫局(OIE)确定为标准方法。当前商品化的IBV抗体检测试剂盒大多采用全病毒粒子包被,对不同血清型的地方毒株的交叉反应性差异较大,加上活病毒纯化困难且存在散播病毒的危险性及检测成本高,使得商品化IBV抗体检测试剂盒的应用受到限制。IBV传统的病原诊断方法虽然准确,但操作复杂、耗时、费力,其它的核酸诊断方法如核酸探针杂交、RT-PCR、...
【文章页数】：62 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
缩略表 Abbreviations
第一章 文献综述
1.1 鸡传染性支气管炎概述
1.2 鸡传染性支气管炎抗体的检测技术
1.2.1 对流免疫电泳(CIE)
1.2.2 琼脂扩散沉淀试验(AGP)
1.2.3 间接血凝抑制试验(PHA)
1.2.4 免疫荧光抗体技术(IFA)
1.2.5 病毒中和试验(VNT)
1.2.6 酶联免疫吸附试验(ELISA)
1.3 环介导等温扩增技术(LAMP)
1.4 本课题的研究目的与意义
第二章 利用IBV重组N蛋白建立间接N-ELISA抗体检测试剂盒的研究
2.1 材料和操作步骤
2.1.1 材料
2.1.2 主要试剂的配制方法
2.1.3 主要仪器设备及耗材
2.1.4 操作步骤
2.2 实验方法
2.2.1 批内重复性试验
2.2.2 批间重复性试验
2.2.3 37℃加速老化试验
2.2.4 符合性试验
2.2.5 4℃和-20℃恒温保存试验
2.2.6 阻断试验
2.2.7 间接ELISA试剂盒的阴阳性判断标准的建立
2.2.8 临床样品血清的检测
2.3 结果
2.3.1 批内重复性试验检测结果
2.3.2 批间重复性试验检测结果
2.3.3 37℃加速试验老化结果
2.3.4 符合性试验结果
2.3.5 保存期试验结果
2.3.6 阻断试验结果
2.3.7 间接ELISA试剂盒阴阳性临界值的确定
2.3.8 临床血清样品的检测结果
2.3.8.1 IBV广西地方分离毒株制备的单价油苗免疫后的血清检测结果
2.3.8.2 养殖公司送检血清样品检测结果
2.3.9 间接N-ELISA试剂盒和IDEXX试剂盒敏感性比较结果
2.4 小结与讨论
2.5 试剂盒使用说明
第三章 反转录环介导等温扩增(RT-LAMP)快速检测IBV方法的建立
3.1 材料和方法
3.1.1 毒株
3.1.2 主要试剂
3.1.3 引物的设计与合成
3.2 LAMP检测方法条件的优化
3.2.0 引物的验证
3.2.1 反应温度的优化
3.2.2 反应时间的优化
3.2.3 甜菜碱浓度的优化
3.2.4 硫酸镁浓度的优化
3.2.5 dNTP浓度的优化
3.2.6 两对引物的优化比例
3.2.7 特异性实验
3.2.8 敏感性试验
3.2.9 重复性和稳定性检测
3.2.9.1 批内重复性试验
3.2.9.2 批间重复性试验
3.2.10 阴阳性的可视化
3.2.11 临床样品的检测
3.2.12 反应最终优化体系成份终浓度表
3.3 结果
3.3.1 引物的验证
3.3.2 反应温度的优化
3.3.3 反应时间的优化
3.3.4 甜菜碱浓度的优化
3.3.5 硫酸镁浓度的优化
3.3.6 dNTP浓度的优化
3.3.7 两对引物比例优化
3.3.8 特异性试验
3.3.9 敏感性试验
3.3.10 重复性和稳定性检测
3.3.11 阴阳性的可视化结果
3.3.12 临床样品检测结果
3.3.13 反应最终优化体系终浓度
3.4 讨论
第四章 结论
参考文献
致谢
攻读学位期间发表论文情况及参与的科研项目
本文编号：3736343
【文章页数】：62 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
缩略表 Abbreviations
第一章 文献综述
1.1 鸡传染性支气管炎概述
1.2 鸡传染性支气管炎抗体的检测技术
1.2.1 对流免疫电泳(CIE)
1.2.2 琼脂扩散沉淀试验(AGP)
1.2.3 间接血凝抑制试验(PHA)
1.2.4 免疫荧光抗体技术(IFA)
1.2.5 病毒中和试验(VNT)
1.2.6 酶联免疫吸附试验(ELISA)
1.3 环介导等温扩增技术(LAMP)
1.4 本课题的研究目的与意义
第二章 利用IBV重组N蛋白建立间接N-ELISA抗体检测试剂盒的研究
2.1 材料和操作步骤
2.1.1 材料
2.1.2 主要试剂的配制方法
2.1.3 主要仪器设备及耗材
2.1.4 操作步骤
2.2 实验方法
2.2.1 批内重复性试验
2.2.2 批间重复性试验
2.2.3 37℃加速老化试验
2.2.4 符合性试验
2.2.5 4℃和-20℃恒温保存试验
2.2.6 阻断试验
2.2.7 间接ELISA试剂盒的阴阳性判断标准的建立
2.2.8 临床样品血清的检测
2.3 结果
2.3.1 批内重复性试验检测结果
2.3.2 批间重复性试验检测结果
2.3.3 37℃加速试验老化结果
2.3.4 符合性试验结果
2.3.5 保存期试验结果
2.3.6 阻断试验结果
2.3.7 间接ELISA试剂盒阴阳性临界值的确定
2.3.8 临床血清样品的检测结果
2.3.8.1 IBV广西地方分离毒株制备的单价油苗免疫后的血清检测结果
2.3.8.2 养殖公司送检血清样品检测结果
2.3.9 间接N-ELISA试剂盒和IDEXX试剂盒敏感性比较结果
2.4 小结与讨论
2.5 试剂盒使用说明
第三章 反转录环介导等温扩增(RT-LAMP)快速检测IBV方法的建立
3.1 材料和方法
3.1.1 毒株
3.1.2 主要试剂
3.1.3 引物的设计与合成
3.2 LAMP检测方法条件的优化
3.2.0 引物的验证
3.2.1 反应温度的优化
3.2.2 反应时间的优化
3.2.3 甜菜碱浓度的优化
3.2.4 硫酸镁浓度的优化
3.2.5 dNTP浓度的优化
3.2.6 两对引物的优化比例
3.2.7 特异性实验
3.2.8 敏感性试验
3.2.9 重复性和稳定性检测
3.2.9.1 批内重复性试验
3.2.9.2 批间重复性试验
3.2.10 阴阳性的可视化
3.2.11 临床样品的检测
3.2.12 反应最终优化体系成份终浓度表
3.3 结果
3.3.1 引物的验证
3.3.2 反应温度的优化
3.3.3 反应时间的优化
3.3.4 甜菜碱浓度的优化
3.3.5 硫酸镁浓度的优化
3.3.6 dNTP浓度的优化
3.3.7 两对引物比例优化
3.3.8 特异性试验
3.3.9 敏感性试验
3.3.10 重复性和稳定性检测
3.3.11 阴阳性的可视化结果
3.3.12 临床样品检测结果
3.3.13 反应最终优化体系终浓度
3.4 讨论
第四章 结论
参考文献
致谢
攻读学位期间发表论文情况及参与的科研项目
本文编号：3736343
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/dongwuyixue/3736343.html
