蜡样芽孢杆菌的分离鉴定及NHE基因RPA-LF检测方法的建立

发布时间：2023-02-09 09:43

　　本实验室从一猝死牛脾脏内分离到一株细菌,经鉴定该菌为致病性蜡样芽孢杆菌。由于目前未有蜡样芽孢杆菌侵染牛致死的相关报道,因此对菌株进行分离鉴定,并针对该菌的nhe基因建立RPA-LF检测法,以期对该病的研究及防控提供理论依据。试验通过细菌的形态学观察、生化检测、16S rDNA及groEL基因序列分析等方法对细菌进行鉴定。经药物敏感性、耐酸耐胆盐性、耐高温性、动物致病性及感染鼠病理组织切片观察等试验对其生物学特性进行检测。之后通过PCR检测及碱基序列测定对该菌所含毒力基因进行检测分析,再针对该菌的毒力基因nhe建立RPA-LF快速检测法。试验结果可见,该菌为革兰氏阳性杆菌,呈单个或链状排列,生化检测、16S rDNA及groEL基因分析表明该菌株为蜡样芽孢杆菌;生物学特性检测结果显示该菌对头孢氨苄、庆大霉素、诺氟沙星等药物敏感,具有耐酸性、不耐胆盐、与其他蜡样芽孢杆菌相比耐高温性不强,对小鼠有较强的致死性且可导致小鼠各脏器发生不同程度的病变;毒力基因检测结果表明该菌含有毒素hbl、nhe、entFM、cytk的毒力基因:经优化,nhe基因RPA-LF检测法的最佳反应温度为38℃、最低有效...

【文章页数】：59 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略词表
1 引言
    1.1 蜡样芽孢杆菌的概述
    1.2 蜡样芽孢杆菌毒素的概述
        1.2.1 呕吐型肠毒素
        1.2.2 腹泻型肠毒素
        1.2.3 细胞毒素K
        1.2.4 肠毒素Ⅱ
    1.3 重组酶聚合酶扩增技术
        1.3.1 RPA反应原理
        1.3.2 引物设计原则
        1.3.3 常见检测方法
2 试验材料
    2.1 主要试剂及仪器
    2.2 菌株及实验动物
3 试验方法
    3.1 目的及意义
    3.2 技术路线
    3.3 细菌的分离鉴定
        3.3.1 培养基的制备
        3.3.2 细菌的分离纯化
        3.3.3 细菌的形态学特征观察
        3.3.4 细菌的生理生化试验
        3.3.5 分离菌的药敏检测
        3.3.6 分离菌的抑菌试验
        3.3.7 耐酸、耐胆盐试验
        3.3.8 耐高温试验
        3.3.9 分离菌16SrDNA检测
        3.3.10 分离菌致病性检测
        3.3.11 感染鼠病理组织学观察
    3.4 分离菌毒力基因鉴定
        3.4.1 毒力基因的检测
        3.4.2 毒力基因的对比分析
    3.5 非溶血性肠毒素RPA检测方法的建立
        3.5.1 引物及探针的设计
        3.5.2 RPA-LF反应体系的建立
        3.5.3 反应条件的优化
        3.5.4 特异性试验
        3.5.5 灵敏性试验
4 试验结果
    4.1 细菌的分离鉴定
        4.1.1 培养及镜检
        4.1.2 生理生化特性
        4.1.3 药物敏感性
        4.1.4 抑菌性
        4.1.5 耐酸、耐胆盐性
        4.1.6 耐高温性
        4.1.7 16S rDNA检测
        4.1.8 致病性检测
        4.1.9 感染鼠病理组织学观察
    4.2 毒力基因鉴定
        4.2.1 毒力基因的PCR扩增
        4.2.2 毒力基因遗传变异分析
    4.3 非溶血性肠毒素RPA-LF的建立
        4.3.1 RPA反应条件的优化
        4.3.2 特异性试验
        4.3.3 灵敏性试验
5 讨论
6 结论
参考文献
致谢
作者简介
附录



本文编号：3738664