Myostatin DNA疫苗及前肽蛋白免疫动物对肌肉生长的影响

发布时间：2023-02-09 19:31

　　Myostatin,肌肉生长抑制素,是肌肉生长发育的抑制因子。本研究针对Myostatin前肽和成熟肽分别制备拮抗剂与疫苗,从细胞和动物个体水平验证这两种生物制剂对绵羊骨骼肌发育的影响。主要研究内容及结果如下:1.绵羊Myostatin前肽对成肌细胞分化的作用。构建和包装Myostatin前肽过表达慢病毒载体,制备慢病毒,分别用慢病毒感染C2C12细胞,检测Myostatin前肽对C2C12细胞分化的影响。结果对照组和试验组肌管融合率分别为5.62%和9.38%,试验组的肌管融合率显著高于对照组(P<0.05)。结果表明Myostatin前肽基因的过表达可能抑制了Myostatin,从而促进了肌管的形成。2.Myostatin前肽蛋白在毕赤酵母中的表达。根据毕赤酵母密码子的偏嗜性及Myostatin前肽蛋白特定位点突变后生物学活性增强的特性,完成对羊Myostatin前肽基因序列的密码子优化,并将第76位的天冬氨酸(Asp)突变成丙氨酸(Ala)。将修饰后的Myostatin前肽基因克隆至酵母表达载体pPIC9K,构建酵母表达重组质粒pPIC9K-Msp。用电转化把重组质粒转入毕...

【文章页数】：108 页

【学位级别】：博士

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摘要
Abstract
英文缩写词表
第一章 绪论
    1 研究目的与意义
    2 国内外研究进展
        2.1 Myostatin基因研究进展
            2.1.1 Myostatin的发现与研究进展
            2.1.2 Myostatin基因的分子结构及同源性
            2.1.3 Myostatin蛋白的合成及生物学特性
            2.1.4 Myostatin的信号通路
            2.1.5 Myostatin基因的生物学功能
            2.1.6 Myostatin拮抗剂的研究进展
            2.1.7 Myostatin抗体的研究进展
        2.2 疫苗研究进展
            2.2.1 传统疫苗
            2.2.2 核酸疫苗
            2.2.3 核酸疫苗的免疫机理
            2.2.4 乙肝表面抗原增强免疫原性的研究
    3 研究内容与技术路线
第二章 试验研究
    试验一 绵羊Myostatin前肽对成肌细胞的分化作用
        1 材料与方法
            1.1 实验试剂
            1.2 慢病毒载体、包装细胞和菌株
            1.3 实验方法
                1.3.1 Myostatin前肽过表达慢病毒重组质粒的构建及制备
                1.3.2 包装细胞株293T细胞的培养
                1.3.3 Myostatin前肽过表达慢病毒的包装
                1.3.4 滴度检测
                1.3.5 C2C12细胞培养及转染
                1.3.6 成肌细胞分化诱导及其指标测定
                1.3.7 Westernblot检测蛋白表达
        2 结果
            2.1 Myostatin前肽克隆
            2.2 Myostatin前肽过表达慢病毒载体的构建和鉴定
            2.3 WB检测结果
            2.4 滴度结果
            2.5 过表达Myostatin前肽对成肌细胞的分化
                2.5.1 免疫荧光检测结果
                2.5.2 肌管融合率的测定
        3 讨论
        4 小结
    试验二 Myostatin前肽蛋白在毕赤酵母中的表达
        1 材料与方法
            1.1 实验材料
                1.1.1 菌株和质粒
                1.1.2 工具酶和生化试剂
                1.1.3 培养基
            1.2 方法
                1.2.1 Myostatin前肽蛋白密码子优化及突变
                1.2.2 pPIC9K-Msp重组质粒的构建
                1.2.3 电转化毕赤酵母GS115
                1.2.4 压力筛选
                1.2.5 重组酵母转化子的诱导表达
                1.2.6 WesternBlot鉴定Myostatin前肽的表达
        2 结果
            2.1 重组质粒pPIC9K-Msp的构建及酶切鉴定
            2.2 压力筛选
            2.3 重组质粒pPIC9K-Msp的PCR鉴定
            2.4 表达产物SDS-PAGE和Westernblot鉴定
        3 讨论
        4 小结
    试验三 Myostatin前肽蛋白在大肠杆菌中的表达
        1 材料与方法
            1.1 实验材料
                1.1.1 菌株和质粒
                1.1.2 工具酶和生化试剂
            1.2 方法
                1.2.1 引物的设计
                1.2.2 PCR扩增
                1.2.3 PCR产物胶回收
                1.2.4 克隆载体pMD18-M的构建
                1.2.5 重组质粒的构建
                1.2.6 目的蛋白表达
                1.2.7 目的蛋白的纯化
        2 结果
            2.1 质粒构建
            2.2 绵羊突变型Myostatin前肽蛋白序列的扩增
            2.3 蛋白表达产物的分析
        3 讨论
        4 小结
    试验四 Myostatin前肽蛋白对羔羊肌肉生长的影响
        1 材料与方法
            1.1 试验动物选择
            1.2 试验时间地点
            1.3 实验方法
                1.3.1 实验设计
                1.3.2 屠宰实验
                1.3.3 测定指标
                1.3.4 采集样品
                1.3.5 HE染色切片制作程序
                1.3.6 荧光定量PCR
                1.3.7 数据处理与统计分析
        2 实验结果
            2.1 注射Myostatin前肽重组蛋白对羔羊肌肉生长的作用
            2.2 利用Myostatin前肽重组蛋白动物模型,研究肌肉纤维增大的生理和分子机制
            2.3 注射Myostatin前肽后对Myostatin信号通路下游及相关基因的影响
        3 讨论
        4 小结
    试验五 Myostatin成熟肽核酸疫苗的制备及对小鼠肌肉生长的影响
        1 材料与方法
            1.1 实验材料
                1.1.1 菌株和质粒
                1.1.2 工具酶和生化试剂
            1.2 实验方法
                1.2.1 细菌基因组DNA的提取
                1.2.2 核酸疫苗pV-SM的构建
                1.2.3 质粒的大量培养及抽提纯化
                1.2.4 实验动物的选择
                1.2.5 免疫方法
                1.2.6 样品采集
                1.2.7 组织切片
                1.2.8 荧光定量PCR
                1.2.9 抗体检测
                1.2.10 数据处理与统计分析
        2 实验结果
            2.1 Myostatin成熟肽核酸疫苗的制备
            2.2 免疫Myostatin成熟肽核酸疫苗后对实验小鼠体重的影响
            2.3 免疫Myostatin成熟肽核酸疫苗后对实验小鼠肌纤维的影响
            2.4 免疫小鼠抗血清的检测
            2.5 免疫Myostatin成熟肽核酸疫苗后对小鼠Myostatin信号通路下游相关基因影响
        3 讨论
            3.1 对BALB/c小鼠肌肉生长的影响
            3.2 Myostatin成熟肽核酸疫苗产生免疫应答的机制
        4 小结
    试验六 Myostatin成熟肽核酸疫苗对羔羊肌肉生长的影响
        1 材料与方法
            1.1 实验材料
            1.2 实验方法
                1.2.1 试验动物的选择
                1.2.2 免疫方法
                1.2.3 屠宰实验
                1.2.4 测定指标
                1.2.5 采集样品
                1.2.6 组织切片
                1.2.7 荧光定量PCR
                1.2.8 抗体检测
                1.2.9 数据处理与统计分析
        2 实验结果
            2.1 免疫Myostatin成熟肽核酸疫苗后对实验羔羊体重的影响
            2.2 免疫Myostatin核酸疫苗后对实验羔羊肌纤维的影响
            2.3 免疫羔羊抗血清的检测
            2.4 免疫Myostatin成熟肽核酸疫苗后对羔羊Myostatin信号通路下游相关基因影响
        3 讨论
            3.1 载体的选择
            3.2 试验动物的选择
            3.3 对羔羊肌肉生长的影响
        4 小结
第三章 结论
第四章 论文创新点
参考文献
附录1 主要仪器设备
附录2 溶液及培养基配置
作者简介
致谢
石河子大学博士研究生学位论文导师评阅表



本文编号：3739121