牛精子RNA对早期胚胎发育影响的初步研究

发布时间：2017-05-17 19:05

  本文关键词：牛精子RNA对早期胚胎发育影响的初步研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：最近研究显示在受精过程中一些精子RNAs被带入卵母细胞中,它们能保持稳定至到胚胎基因组被激活的时期,这些研究暗示在受精过程中带入的RNAs参与早期胚胎形成和(或)发育,对早期胚胎发育有重要的作用。由于精子特殊的外膜结构及RNA含量极低等特点,高质量的精子RNA提取一直是阻碍精子RNA深入研究的障碍之一。本实验旨在优化牛精子RNA的提取方法以及初步研究精子RNA对牛体细胞克隆胚早期发育的影响。本实验优化了传统TRIzol提取精子RNA的方法,主要改进了三个实验条件:即加TRIzol前加入适量的缓冲裂解液、提高TRIzol的裂解温度(65℃)以及延长异丙醇的处理时间(2-3小时甚至过夜)。与传统TRIzol法相比,改进的TRIzol法显著改善了当精子浓度为×107时提取的总RNA产量(2,800 ng VS 2,9000 ng)和纯度(OD260/2801.60 VS 1.88)。为了探索精子RNA对早期胚胎发育的影响,本试验通过电融合方法将所提取的高纯度和高浓度的RNA转入核质复合体中,分析精子RNA对体细胞克隆胚早期发育的影响。实验结果表明转入精子RNAs后,囊胚内总细胞数(104.45±5.24 VS 102.36±3.21,P0.05)相比对照组差异不显著;但牛克隆胚胎卵裂率(86.3%±1.23%VS75.2%±1.57%,P0.05)、囊胚率(35.8%±0.87%VS 28.6%±1.10%,P0.05)显著提高而胚胎凋亡率(2.8%±0.23%VS 5.8%±0.11%,P0.05)显著降低。干性基因OCT4、SOX2在囊胚中的表达量显著高于对照组(P0.05)。本实验优化了牛精子RNA的提取方法,通过体细胞克隆胚精子RNA电融合实验初步表明其对早期胚胎发育具有重要的影响,为进一步探索精子RNA对早期胚胎的发育调控,及提高体细胞克隆效率做了铺垫。
【关键词】：精子RNA 克隆胚胎 早期发育 牛
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S823
【目录】：

• 摘要6-7
• ABSTRACT7-11
• 文献综述11-20
• 第一章 精子RNA研究进展11-20
• 1.1 精子细胞形成过程11-12
• 1.2 精子形成期间的RNA转录、储存和传递12-13
• 1.3 成熟精子中的mRNA及其功能13-15
• 1.3.1 成熟精子中mRNA的研究概况13-14
• 1.3.2 成熟精子中mRNA在受精后卵母细胞中的作用14
• 1.3.3 成熟精子中mRNA的潜在功能14-15
• 1.4 成熟精子中干扰RNA及其功能15-16
• 1.5 成熟精子中无意义RNA的研究16-17
• 1.6 精子携带的外源RNA及其功能17-18
• 1.7 精子RNA在胚胎发育过程中的作用18-20
• 实验部分20-45
• 第二章 牛成熟精子RNA的提取与鉴定20-33
• 2.1 材料与试剂20-22
• 2.1.1 实验材料20
• 2.1.2 主要试剂及配制20-21
• 2.1.3 实验仪器设备21-22
• 2.2 实验方法22-26
• 2.2.1 牛附睾和睾丸的采集22
• 2.2.2 精子提取与收集22
• 2.2.3 精子质量的鉴定22-23
• 2.2.4 精子总RNA的提取23-24
• 2.2.5 睾丸总RNA的提取24
• 2.2.6 总RNA的纯化24
• 2.2.7 精子及睾丸总RNA的反转录24-25
• 2.2.8 总RNA质量鉴定25-26
• 2.3 结果26-31
• 2.3.1 精子纯度分析26-28
• 2.3.2 提取RNA的最佳精子浓度的筛选28-29
• 2.3.3 不同提取方式对精子RNA质量的影响分析29-30
• 2.3.4 不同提取方式对睾丸组织RNA质量的影响分析30-31
• 2.4 讨论31
• 2.5 小结31-33
• 第三章 精子RNA对早期胚胎发育影响的初步研究33-45
• 3.1 材料与试剂33-35
• 3.1.1 实验材料33
• 3.1.2 仪器设备33-34
• 3.1.3 主要试剂及配置34-35
• 3.2 实验方法35-39
• 3.2.1 供体细胞的准备35
• 3.2.2 卵母细胞的收集和体外成熟35
• 3.2.3 重构胚的构建35-36
• 3.2.4 电融合36
• 3.2.5 重构胚的激活和体外培养36
• 3.2.6 体外受精及胚胎的培养36-37
• 3.2.7 囊胚细胞计数37
• 3.2.8 囊胚凋亡染色37-38
• 3.2.9 胚胎cDNA制备38
• 3.2.10 定量PCR检测分析38-39
• 3.3 结果39-43
• 3.3.1 向卵母细胞中电融合精子RNA的最佳浓度的筛选39-40
• 3.3.2 精子RNA处理对SCNT卵裂率和囊胚率的影响40-41
• 3.3.3 精子RNA处理对SCNT囊胚凋亡的影响41
• 3.3.4 精子RNA处理对体细胞核移植囊胚发育相关基因表达的影响41-43
• 3.4 讨论43-44
• 3.5 小结44-45
• 全文结论45-46
• 参考文献46-51
• 致谢51-52
• 作者简介52

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