大熊猫阴道微生物多样性及部分真菌生物学特性研究

发布时间：2023-02-16 18:14

　　大熊猫繁殖能力极低,种群数量较少,虽然近年来大熊猫人工繁育技术已取得显著成果,但总体还存在大熊猫屡配不孕等繁殖问题。阴道定植着数量巨大、不同种属的微生物,其对机体健康具有重要的作用。细菌性或真菌性阴道病是一种阴道微生物群落紊乱性疾病,可能与众多的不良后果如早产及感染性疾病等有关,尤其疾病的发生发展与菌群组成和丰度有密不可分的联系。大熊猫的繁殖障碍因素很多,本研究拟通过培养和非培养方法研究大熊猫阴道内微生物,掌握其种群和丰度,为研究微生物在大熊猫繁殖障碍中的作用奠定基础。采用454高通量测序及生物信息学分析方法研究21只大熊猫阴道微生物种类及其优势菌种,同时研究了大熊猫阴道内可培养真菌种群及其部分高丰度真菌生物学特性。结果表明:(1)在21只大熊猫阴道样本中共检测到16 S rRNA优化序列224 110条,共分为6 650个OTUs,23个门,618个属,2 147个种,但其中有3个门,136个属,184个种无法鉴定。在各个不同分类水平上确定了优势种类。优势的门分别是:厚壁菌门(54.44%)、变形菌门(39.13%)、拟杆菌门(5.70%)、放线菌门(4.07%)等;优势的属分别是:...

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【学位级别】：博士

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摘要
ABSTRACT
前言
上篇 文献综述
    第一章 分子生态学技术在生殖道微生物群落结构领域的研究进展
        1 DNA指纹图谱技术在生殖道微生物研究中的进展
            1.1 T-RFLP技术在生殖道微生物研究中的进展
            1.2 DGGE/TGGE在生殖道微生物中的进展
            1.3 RAPD在生殖道微生物研究中的进展
            1.4 AFLP在生殖道微生物中的进展
            1.5 SSCP在生殖道微生物研究中的进展
        2 核酸探针技术在生殖道微生物研究中的进展
            2.1 荧光原位杂交技术在生殖道微生物研究中的进展
            2.2 基因芯片技术在生殖道微生物研究中的进展
        3 基于PCR的技术在生殖道微生物研究中的进展
            3.1 实时荧光定量PCR技术在生殖道微生物研究中的进展
    第二章 组学时代泌尿生殖道微生物研究进展
        1 宏基因组学的产生背景
        2 宏基因组中的泌尿生殖道微生物研究进展
            2.1 女性阴道微生物群落组成及多样性分析
            2.2 女性尿液微生物群落组成及多样性分析
            2.3 男性泌尿生殖道微生物群落组成及多样性分析
            2.4 动物阴道微生物群落组成及多样性分析
            2.5 宏基因组在检测阴道微生物分型中的应用
        3 宏转录组研究阴道微生物群落功能
    小结
    参考文献
下篇 试验研究
    第三章 454高通量测序研究大熊猫阴道细菌多样性
        1 材料与方法
            1.1 材料
                1.1.1 主要仪器
                1.1.2 主要试剂
                1.1.3 大熊猫阴道样本的来源
                1.1.4 大熊猫阴道样本的采集
            1.2 方法
                1.2.1 基因组DNA抽提及鉴定
                1.2.2 454焦磷酸测序
                1.2.3 生物信息学分析
        2 结果
            2.1 样品采集结果
            2.2 PCR预试验电泳检测
            2.3 标准曲线
            2.4 定量
            2.5 统计分析结果
                2.5.1 焦磷酸测序结果
                2.5.2 OTU聚类分析
                2.5.3 多样性分析(Alpha-diversity)结果
                2.5.4 稀释性曲线(Rarefaction cuve)分析结果
                2.5.5 Shannon-Wiener曲线分析结果
                2.5.6 分类学分析(Taxonomy)
                2.5.7 群落结构分析(CommunityStructure)
                2.5.8 Heatmap
                2.5.9 PCA分析(Principal Component Analysis)结果
        3 讨论
            3.1 生物信息学分析讨论
            3.2 产乳酸的微生物分析
            3.3 产乳酸的微生物在生殖道中的作用
            3.4 微生物引起大熊猫繁殖困难的可能原因分析
            3.5 研究方法分析
        小结
        参考文献
    第四章 454高通量测序研究大熊猫阴道真核生物多样性
        1 材料与方法
            1.1 材料
                1.1.1 主要仪器
                1.1.2 材料
                1.1.3 大熊猫阴道样本的来源
                1.1.4 大熊猫阴道样本的采集
            1.2 方法
                1.2.1 基因组DNA抽提及鉴定
                1.2.2 454焦磷酸测序
                1.2.3 PCR正式试验
                1.2.4 荧光定量
                1.2.5 生物信息学分析
        2 结果
            2.1 样品采集结果
            2.2 PCR扩增结果
                2.2.1 预试验9个样本DNA提取结果
                2.2.2 重复试验12个样本DNA提取结果
            2.3 标准曲线
            2.4 定量
            2.5 统计分析结果
                2.5.1 焦磷酸测序结果
                2.5.2 OTU聚类分析
                2.5.3 多样性分析(Alpha-diversity)结果
                2.5.4 稀释性曲线(Rarefaction curve)分析结果
                2.4.5 shannon-Wiener曲线分析结果
                2.5.6 分类学分析(Taxonomy)
                2.5.7 群落结构分析(Community Structure)
                2.5.8 Heatmap
                2.5.9 PCA分析(Principal Component Analysis)结果
        3 讨论
            3.1 生物信息分析结果
            3.2 在各个水平上的分类
                3.2.1 在门水平上的分类
                3.2.2 在属水平上的分类
                3.2.3 在种水平上的分类
            3.3 大熊猫繁殖障碍相关微生物种群与致病性分析
        小结
        参考文献
    第五章 大熊猫阴道真菌的分离与鉴定
        1 材料与方法
            1.1 材料
                1.1.1 主要仪器
                1.1.2 主要试剂
                1.1.3 主要培养基
                1.1.4 部分溶液的配制
                1.1.5 PCR引物
            1.2 方法
                1.2.1 采样
                1.2.2 真菌的分离培养
                1.2.3 真菌的形态学鉴定
                1.2.4 真菌rDNA序列分析
                1.2.5 测序鉴定
        2 结果
            2.1 霉菌的形态学特征
            2.2 类酵母样真菌的形态学特征
            2.3 酵母样真菌的形态学特征
            2.4 电泳结果
            2.5 真菌鉴定结果
        3 讨论
            3.1 大熊猫阴道可培养真菌种类组成分析
            3.2 真菌鉴定方法对研究结果的影响
            3.3 大熊猫阴道真菌种群及对繁殖的影响
            3.4 大熊猫阴道样本中最常见真菌种群
        小结
        参考文献
    第六章 大熊猫阴道链格孢菌的生物学特性研究
        1 材料与方法
            1.1 试验菌株
            1.2 主要仪器
            1.3 培养基
            1.4 生态因子对链格孢菌菌落生长的影响
                1.4.1 不同培养基对链格孢菌生长的影响
                1.4.2 不同温度对链格孢菌生长的影响
                1.4.3 不同pH对链格孢菌生长的影响
                1.4.4 不同碳源对链格孢菌生长的影响
                1.4.5 不同氮源对链格孢菌生长的影响
        2 结果与分析
            2.1 生态因子对链格孢菌菌落生长的影响
                2.1.1 不同培养基对链格孢菌生长的影响
                2.1.2 不同温度对链格孢菌生长的影响
                2.1.3 不同pH对链格孢菌生长的影响
                2.1.4 不同碳源对链格孢菌生长的影响
                2.1.5 不同氮源对链格孢菌生长的影响
        3 讨论
        小结
        参考文献
    第七章 大熊猫阴道链状假丝酵母菌的生物学特性
        1 材料与方法
            1.1 实验菌种
            1.2 材料及器材
                1.2.1 试验材料
                1.2.2 器材
                1.2.3 培养基
            1.3 试验方法
                1.3.1 菌种活化
                1.3.2 菌落观察
                1.3.3 菌体菌丝观察
                1.3.4 生长曲线
                1.3.5 芽管试验
                1.3.6 链状假丝酵母菌的生化特性
        2 试验结果
            2.1 菌落形态
                2.1.1 SDA培养基上的菌落形态
                2.1.2 玉米培养基上的菌落形态
            2.2 菌体
                2.2.1 菌体形态
                2.2.2 菌体大小
            2.3 菌丝
                2.3.1 假菌丝形态
                2.3.2 真菌丝形态
                2.3.3 链状假丝酵母菌假菌丝与真菌丝的特点
            2.4 孢子
            2.5 生长
            2.5 芽管试验
            2.6 链状假丝酵母菌的生化特性
                2.6.1 碳源同化试验
                2.6.2 糖酵解试验
                2.6.3 尿素试验
                2.6.4 耐放线菌酮试验
                2.6.5 显色试验
        3 讨论
            3.1 菌体形态大小差异
            3.2 假菌丝分枝点
            3.3 菌体菌丝关系
            3.4 生长过程
            3.5 生化试验
        小结
        参考文献
全文总结
创新之处
攻读博士期间发表论文、成果、科研项目及参加学术会议
致谢



本文编号：3744260