猪流产嗜性衣原体单抗制备及阻断ELISA检测方法的建立

发布时间：2023-02-18 20:19

　　流产嗜性衣原体(Chlamydophila abortus, C. abortus)是引起猪、牛、羊等家畜流产、死胎等繁殖系统疾病的重要病原体,每年给畜牧养殖业造成重大的经济损失。同时,作为一种重要的人畜共患病原体,也给人类的公共卫生安全带来严重的危害。近几年来的猪场流行病学调查结果表明,我国猪场中衣原体流行相当普遍。目前,猪场中都没有使用衣原体疫苗进行免疫预防,因此检测血清中抗体可以作为该病临床诊断的重要依据。因此,本研究利用重组MOMP蛋白和单克隆抗体建立一种快速、简便的阻断ELISA抗体检测方法,为临床检测提供技术支持。1.猪流产嗜性衣原体MOMP克隆表达 以猪流产嗜性衣原体HB1043株的全基因组DNA为模板,设计特异性引物进行PCR,扩增得到全长的MOMP基因,连接T载体并测序。对基因序列进行分析后,选择271-1176bp进行克隆表达。构建重组表达质粒pET-28a-MOMP,转化BL21进行诱导表达,并采用镍离子亲合层析柱对表达产物纯化,得到34kDa的重组蛋白,经Western-Blot检测证实重组蛋白具有免疫学活性。 2. MOMP单克隆抗体制备 使用甲醛灭活的衣原体...

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目录
摘要
Abstract
缩略语表
1 前言
    1.1 衣原体概述
        1.1.1 衣原体分类
        1.1.2 主要生理特性
        1.1.3 衣原体危害
    1.2 猪流产嗜性衣原体病研究进展
        1.2.1 临床症状及病理变化
        1.2.2 治疗与预防
        1.2.3 主要抗原蛋白研究进展
        1.2.4 流行病学
    1.3 猪流产嗜性衣原体检测技术研究进展
        1.3.1 传统检测
        1.3.2 分子生物学检测
        1.3.3 血清学检测
    1.4 研究目的与意义
2 材料与方法
    2.1 试验材料
        2.1.1 病原、血清、细胞及试验动物
        2.1.2 主要试剂
        2.1.3 试剂配制
        2.1.4 主要仪器
    2.2 试验方法
        2.2.1 猪流产嗜性衣原体MOMP克隆表达
        2.2.2 MOMP单克隆抗体制备
        2.2.3 单克隆抗体酶标
        2.2.4 阻断ELISA抗体检测方法建立
3 结果与分析
    3.1 MOMP克隆表达结果
        3.1.1 目的基因扩增及分析
        3.1.2 诱导表达与纯化
        3.1.3 Western-Blot检测
        3.1.4 间接ELISA包被浓度与血清稀释度选择
        3.1.5 临界值确定
    3.2 MOMP单克隆抗体制备
        3.2.1 小鼠免疫后效价检测
        3.2.2 杂交瘤细胞染色体计数
        3.2.3 型分析
        3.2.4 腹水效价检测
        3.2.5 腹水纯化
    3.3 单抗酶标
    3.4 阻断ELISA抗体检测方法建立
        3.4.1 参考血清效价检测
        3.4.2 抗原包被及酶标单抗工作浓度选择
        3.4.3 血清稀释度选择
        3.4.4 酶标单抗反应时间
        3.4.5 血清反应时间
        3.4.6 临界值确定
        3.4.7 交叉反应
        3.4.8 重复性
        3.4.9 符合性
        3.4.10 稳定性
4 讨论
    4.1 抗原蛋白的选择
    4.2 表达载体的选择
    4.3 单克隆抗体制备
    4.4 阻断ELISA方法
5 结论
参考文献
附录1
附录2
致谢



本文编号：3745464