不同致病型IBV感染对鸡TLR3和TLR7信号通路的影响及ISG影响IBV复制的研究

发布时间：2023-02-20 17:39

　　鸡传染性支气管炎病毒(Avian infectious bronchitis virus,IBV)是冠状病毒科Gamma冠状病毒属的成员,其引起的鸡传染性支气管炎(Infectious bronchitis,IB)是鸡的一种急性高度接触传染性呼吸道疾病。IBV基因组容易变异,导致病毒血清型和致病性多样化,各血清型之间交叉保护作用有限,给养禽业带来很大的经济损失。因此,做好该病的防控具有极其重要的意义。IBV感染致病与免疫机制是IB防控研究的主要方向之一。天然(固有)免疫反应是宿主抵御病毒感染的第一道防线,在宿主防御IBV中起重要作用。研究表明冠状病毒调控天然免疫反应具有多样性和复杂性,导致冠状病毒致病性和免疫性的差异,不同IBV毒株对不同组织的致病性可能与病毒引起的固有免疫反应有关。因此,深入研究不同致病性IBV感染宿主后不同靶组织的天然免疫反应具有重要意义。IBV有多种临床致病型,其中呼吸型和肾型为两种主要的致病型。本课题应用不同血清型的呼吸型和肾型IBV毒株分别感染SPF鸡,并对感染鸡气管和肾脏TLR3和TLR7信号通路进行研究,同时研究此两种IBV感染对核转录因子IRF7和NF-...

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摘要
ABSTRACT
中英文缩写词对照表
第一章 文献综述
    1.1 IBV研究进展
        1.1.1 IBV概述
        1.1.2 IBV基因组
        1.1.3 IBV结构蛋白
        1.1.4 IBV复制
        1.1.5 IBV的致病性
    1.2 天然免疫研究进展
        1.2.1 模式识别受体及其信号通路
            1.2.1.1 TLR信号通路
            1.2.1.2 RLR信号通路
            1.2.1.3 NLR信号通路
        1.2.2 核转录因子
            1.2.2.1 IRF7
            1.2.2.2 NF-κB
        1.2.3 细胞因子
            1.2.3.1 促炎症因子
            1.2.3.2 趋化因子
            1.2.3.3 Ⅰ型IFN
        1.2.4 ISG
            1.2.4.1 Viperin
            1.2.4.2 IFIT5
    1.3 IBV天然免疫应答研究进展
    1.4 本研究目的和意义
第二章 IBV感染对鸡气管和肾脏TLR3和TLR7信号通路的影响
    2.1 试验材料
        2.1.1 病毒
        2.1.2 SPF鸡胚和鸡
        2.1.3 主要试剂和抗体
        2.1.4 主要仪器
    2.2 试验方法
        2.2.1 病毒增殖与EID50测定
        2.2.2 IBV人工感染SPF鸡
        2.2.3 样品采集与处理
        2.2.4 组织病理学观察
            2.2.4.1 组织切片制备
            2.2.4.1 苏木素-伊红染色
        2.2.5 RNA抽提
        2.2.6 反转录
        2.2.7 引物设计与合成
        2.2.8 荧光定量PCR标准曲线建立
            2.2.8.1 PCR扩增目的基因
            2.2.8.2 扩增产物的回收和克隆
            2.2.8.3 阳性质粒抽提
            2.2.8.4 标准曲线建立
        2.2.9 荧光定量PCR检测
        2.2.10 ELISA检测
        2.2.11 Western Blot检测
        2.2.12 免疫组织化学检测
        2.2.13 数据处理与分析
    2.3 试验结果
        2.3.1 IBV感染后SPF鸡临床症状、剖检病变与死亡情况
        2.3.2 IBV感染后SPF鸡气管黏膜和肾脏组织病理变化
        2.3.3 IBV感染后SPF鸡气管黏膜和肾脏组织病毒载量变化
        2.3.4 IBV感染对SPF鸡气管黏膜和肾脏组织TLR3和TLR7及其接头分子mRNA表达的影响
        2.3.5 IBV感染对SPF鸡气管黏膜和肾脏组织TLR3蛋白表达的影响
        2.3.6 IBV感染对SPF鸡气管黏膜和肾脏组织TLR3蛋白分布的影响
        2.3.7 IBV感染对SPF鸡气管黏膜和肾脏组织信号通路关键分子mRNA表达的影响
        2.3.8 IBV感染对SPF鸡气管黏膜和肾脏组织促炎症和抗炎症细胞因子mRNA和蛋白表达的影响
        2.3.9 IBV感染对SPF鸡气管黏膜和肾脏组织I型IFN mRNA和蛋白表达的影响
        2.3.10 IBV感染对SPF鸡气管黏膜和肾脏组织ISG mRNA表达的影响
    2.4 讨论
    2.5 小结
第三章 IBV感染对鸡气管和肾脏对核转录因子IRF7和NF-κB p65表达的影响
    3.1 试验材料
        3.1.1 病毒
        3.1.2 SPF鸡胚和SPF鸡
        3.1.3 质粒
        3.1.4 抗体
        3.1.5 主要试剂
        3.1.6 主要仪器
        3.1.7 蛋白纯化及复性溶液
            3.1.7.1 包涵体蛋白纯化试剂
            3.1.7.2 包涵体蛋白复性液
    3.2 试验方法
        3.2.1 鸡IRF7蛋白多克隆抗体制备
            3.2.1.1 引物设计与合成
            3.2.1.2 PCR扩增鸡IRF7基因
            3.2.1.3 扩增产物的回收和克隆
            3.2.1.4 构建鸡IRF7原核表达质粒
            3.2.1.5 鸡IRF7蛋白诱导表达与鉴定
            3.2.1.6 鸡IRF7蛋白纯化和复性
            3.2.1.7 免疫兔子制备抗体及血清分离
        3.2.2 IBV人工感染SPF鸡
        3.2.3 样品采集与处理
        3.2.4 RNA抽提和反转录
        3.2.5 荧光定量PCR标准曲线建立
        3.2.6 荧光定量PCR检测
        3.2.7 Western Blot检测
        3.2.8 免疫组织化学检测
        3.2.9 数据处理与分析
    3.3 结果
        3.3.1 鸡IRF7原核表达质粒构建
        3.3.2 鸡IRF7原核蛋白的表达与纯化
        3.3.3 鸡IRF7蛋白多抗的反应性检测结果
        3.3.4 IBV感染对SPF鸡气管黏膜和肾脏组织IRF7和NF-κB p65 mRNA表达的影响
        3.3.5 IBV感染对SPF鸡气管和肾脏组织IRF7蛋白表达的影响
        3.3.6 IBV感染对SPF鸡气管和肾脏组织IRF7蛋白分布的影响
        3.3.7 IBV感染对SPF鸡气管组织NF-κB p65蛋白表达的影响
        3.3.8 IBV感染对SPF鸡气管和肾脏组织NF-κB p65蛋白分布的影响
        3.3.9 IBV感染后SPF鸡气管和肾脏组织IBV N蛋白表达变化
        3.3.10 IBV感染后SPF鸡气管黏膜和肾脏组织IBV N蛋白表达的分布
    3.4 讨论
    3.5 小结
第四章 Viperin和IFIT5对IBV体外复制的影响
    4.1 试验材料
        4.1.1 鸡胚、细胞和病毒
        4.1.2 质粒
        4.1.3 抗体
        4.1.4 主要试剂
        4.1.5 主要仪器
    4.2 试验方法
        4.2.1 CEK细胞的制备与培养
        4.2.2 IBV在CEK细胞上的适应与增殖
        4.2.3 TCID50测定
        4.2.4 IBV感染DF1细胞
        4.2.5 shRNA干扰序列筛选
        4.2.6 shRNA慢病毒制备
        4.2.7 稳定表达shRNA DF1细胞的筛选
        4.2.8 构建真核表达质粒
            4.2.8.1 引物设计与合成
            4.2.8.2 鸡Viperin和IFIT5基因的扩增
            4.2.8.3 扩增产物的回收和克隆
            4.2.8.4 扩增产物同源重组连接pEGFP N1载体
        4.2.9 质粒抽提
        4.2.10 转染DF1细胞
        4.2.11 RNA抽提与反转录
        4.2.12 荧光定量PCR检测
        4.2.13 Western Blot检测
        4.2.14 间接免疫荧光(IFA)检测
        4.2.15 数据处理与分析
    4.3 试验结果
        4.3.1 IBV M41和GX-YL5毒株在CEK细胞上的适应与增殖
        4.3.2 IBV M41和GX-YL5毒株感染CEK细胞上调Viperin和IFIT5 mRNA表达
        4.3.3 IBV M41和GX-YL5毒株在DF1细胞上的感染和复制
        4.3.4 IBV M41和GX-YL5毒株感染DF1细胞上调Viperin和IFIT5 mRNA表达
        4.3.5 瞬时过表达Viperin对IBV复制的影响
            4.3.5.1 真核表达质粒pEGFP-N1-Viperin的构建
            4.3.5.2 DF1细胞中瞬时过表达鸡Viperin蛋白
            4.3.5.3 过表达Viperin蛋白抑制IBV在DF1细胞的复制
        4.3.6 瞬时过表达IFIT5对IBV复制的影响
            4.3.6.1 真核表达质粒pEGFP-N1-IFIT5的构建
            4.3.6.2 DF1细胞中瞬时过表达鸡IFIT5蛋白
            4.3.6.3 过表达IFIT5蛋白抑制IBV在DF1细胞的增殖
        4.3.7 shRNA慢病毒敲低Viperin mRNA表达对IBV复制的影响
            4.3.7.1 筛选获得稳定表达Viperin shRNA的DF1细胞
            4.3.7.2 三种Viperin shRNA DF1细胞干扰效果评价
            4.3.7.3 敲低DF1细胞Viperin mRNA表达促进IBV的感染
        4.3.8 shRNA慢病毒敲低IFIT5 mRNA表达对IBV复制的影响
            4.3.8.1 筛选获得稳定表达IFIT5 shRNA的DF1细胞
            4.3.8.2 三种IFIT5 shRNA DF1细胞干扰效果评价
            4.3.8.3 敲低DF1细胞IFIT5 mRNA表达促进IBV的感染
    4.4 讨论
    4.5 小结
第五章 结论
本研究创新点
参考文献
致谢
攻读学位期间发表论文情况及参加科研项目



本文编号：3747022